DISCUSSÃO
Desde sua descoberta em meados da década de 1970, a ivermectina tem sido usada com segurança por mais de 700 milhões de pessoas em todo o mundo para tratar oncocercose e filariose linfática; é barato e acessível. Nossos resultados demonstram que o tratamento com ivermectina induz infiltração robusta de células T em tumores de mama por meio da indução de CDI, tornando os tumores “frios” em “quentes”. Ao contrário dos medicamentos quimioterápicos convencionais, esse agente tem o benefício adicional de não suprimir a função imune do hospedeiro, mas tem efeitos imunomoduladores benéficos, tornando-o um parceiro promissor e mecanicista para o bloqueio do ponto de controle imunológico. A liberação e o acúmulo de altos níveis de ATP extracelular emergiram como uma característica chave do microambiente tumoral, e uma marca registrada do CDI. Nós e outros já mostramos anteriormente que a ivermectina é um modulador alostérico positivo da sinalização purinérgica e do eixo ATP/P2X4/P2X7/Panexin-1 que opera tanto em células cancerígenas quanto imunes. Em esplenócitos murinos tratados ex vivo, mostramos que a ivermectina pode atingir seletivamente várias subpopulações imunes de maneira dependente de P2X7 (Fig. 2B, C) e tem atividades de potencialização imunológica associadas a proporções aumentadas de efetores imunológicos versus populações imunossupressoras, incluindo Tregs e células mielóides (Fig. 2A, D). O direcionamento seletivo observado de diferentes populações imunes pela ivermectina é consistente com relatórios anteriores que demonstram que Tregs esplênicas de camundongos (CD4 +CD25 + ) têm maior sensibilidade a doses crescentes (>100 μM) de ATP extracelular em comparação com as células T CD8 + e CD4 + CD25 − 29. Essa sensibilidade diferencial ao ATP extracelular é dependente de P2X7 e está diretamente associada aos níveis de expressão do receptor P2X7 de superfície (células CD4 + CD25 + > CD4 + CD25 − > CD8 + T). Relatórios recentes mostraram que o eixo ATP/P2X7 também opera em MDSC e imunossupressão mediada por MDSC. Isso é consistente com nossa descoberta de que a ivermectina pode atingir seletivamente células mielóides expandidas isoladas de camundongos portadores de tumor ex vivo de uma forma dependente de P2X7. Mais pesquisas serão necessárias para elucidar as sensibilidades relativas de diferentes subconjuntos de MDSC e macrófagos/neutrófilos associados ao tumor (TAMs/TANs) à ivermectina, bem como para validar os efeitos in vivo da ivermectina em vários subconjuntos mielóides dentro do microambiente do tumor e sistematicamente.
Embora a citotoxicidade diferencial dependente de ATP/P2X7 possa ser uma explicação possível para os efeitos imunomoduladores da ivermectina in vivo, relatórios recentes também implicam a liberação de ATP e a sinalização dependente de P2X4 na migração mediada por CXCL12/CXCR4 e recrutamento de células T induzido por inflamação. O papel de P2X4 na ativação, proliferação e migração de células T foi particularmente pronunciado em células T CD4, o que é consistente com nossos próprios dados demonstrando que a ivermectina é particularmente potente em aumentar as taxas CD4 + Teff/Treg em esplenócitos tratados ex vivo (Fig. 2D) e aumentando a infiltração intratumoral com células T CD4 + (Fig. 3D). Assim, a infiltração de tumores por células T em camundongos tratados com ivermectina pode refletir uma combinação de depleção seletiva de células supressivas, bem como efeitos de recrutamento. A atividade sinérgica entre a ivermectina e o bloqueio do ponto de verificação anti-PD-1 na condução da infiltração de células T no microambiente do tumor é particularmente intrigante, pois o PD-1 funciona como um regulador de feedback negativo da sinalização do TCR. A abertura da Panexina-1 (PANX1) controlada por P2X4/P2X7 e a liberação de ATP desempenham um papel central na ativação das células T, fornecendo um loop de alimentação para a liberação de ATP iniciada por TCR e impulsionada por ATP na sinapse imunológica. A capacidade da ivermectina como um modulador alostérico dos receptores P2X4/P2X7/PANX1 para modular a sinalização purinérgica operando tanto no câncer quanto nas células imunes, portanto, pode ser aumentada por níveis elevados de ATP dentro do microambiente tumoral e do contexto imunológico, incluindo a magnitude da quimiocina/sinalização TCR e liberação de ATP por quimiocina/TCR. Consistente com a última possibilidade, demonstramos que o efeito potencializador da ivermectina na relação Teff/Treg parece ser mais forte e sustentado na presença de estimulação de células T via PHA (Fig.2D). Mais estudos serão necessários para desvendar como esses efeitos multifacetados da ivermectina para induzir a morte celular imunogênica do câncer, modular diferencialmente as células imunes e aproveitar o microambiente tumoral rico em ATP, podem contribuir para sua capacidade de sinergizar com o bloqueio do ponto de verificação imune in vivo.
Os inibidores do ponto de verificação imunológico (ICIs) são eficazes como agentes únicos apenas em um pequeno subconjunto de pacientes com câncer. Centenas de ensaios clínicos estão atualmente testando várias combinações de ICIs com agentes experimentais ou aprovados pela FDA. Essas combinações são feitas principalmente com base na eficácia parcial do agente de parceria com pouca ou nenhuma lógica mecanicista para sinergia. É importante ressaltar que análises recentes não encontraram evidências de dados de estudos relatados até o momento de que os ICIs sejam sinérgicos ou aditivos com outras drogas, mas, em vez disso, pode ser observada toxicidade sinérgica. Mostramos que a ivermectina representa um parceiro mecanicista racional para o bloqueio do checkpoint imunológico, demonstrando sinergia genuína quando nenhum dos agentes atuou sozinho. A sinergia entre o bloqueio de PD-1 e a ivermectina está mecanisticamente associada à capacidade da ivermectina de conduzir a morte de células cancerígenas imunogênicas e a infiltração de células T nos tumores, convertendo assim tumores “frios” em “quentes”. Em contraste, a avaliação do potencial terapêutico do bloqueio de PD-1 combinado com agentes quimioterápicos de primeira linha estabelecidos que também são conhecidos por induzir ICD, como a doxorrubicina, em modelos 4T1 semelhantes não conseguiu obter respostas duráveis ou regressões tumorais completas. A doxorrubicina sozinha não induziu infiltração significativa de células T nos tumores e não mostrou atividade sinérgica com o bloqueio de PD-1. A falha da doxorrubicina em tornar os tumores “quentes” ou efetivamente sinergizar com o bloqueio de PD-1 provavelmente reflete seus efeitos imunológicos diretos. A doxorrubicina em concentrações correspondentes aos níveis plasmáticos alcançados em pacientes causa citotoxicidade significativa para células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) (Fig. S3), enquanto níveis fisiologicamente relevantes de ivermectina não mostraram efeitos significativos.
Conforme demonstrado em nosso estudo atual, a combinação de ivermectina e bloqueio do ponto de verificação PD-1 levou à regressão completa do tumor primário em uma fração significativa de animais e com imunidade antitumoral protetora nos respondedores. Continuamos demonstrando que essa nova combinação é eficaz nas configurações neoadjuvante, adjuvante e metastática que mimetizam situações clínicas nas quais ela pode ser usada. Com base em seus novos mecanismos duplos de ação no câncer, a ivermectina também pode potencializar a atividade antitumoral de outros ICIs aprovados pela FDA. Por fim, a ivermectina é barata, tornando-a acessível para todos, incluindo pacientes com câncer em países em desenvolvimento. Os achados pré-clínicos que apresentamos sugerem que a combinação de ivermectina e anticorpo anti-PD1 merece testes clínicos em pacientes com câncer de mama.
MÉTODOS
Ratos e tratamento
Camundongos BALB/c fêmeas foram adquiridos do Charles River Laboratories com 5–8 semanas de idade e alojados nas instalações de cuidados com animais da City of Hope em condições livres de patógenos. Todos os procedimentos foram realizados sob aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Cidade de Hope. Os camundongos foram inoculados com 100.000 células de câncer de mama 4T1 na almofada de gordura mamária direita e, em seguida, palpados para verificar o enxerto do tumor antes de iniciar o regime de tratamento atribuído. Os tratamentos incluíram: 5 mg/kg de ivermectina (Sigma Aldrich, St. Louis MO) administrado por sonda oral diariamente durante 6 dias; 10 mg/kg de tratamento anti-PD1 (BioXCell, West Lebanon NH) administrado por via subcutânea uma vez por semana; MSA-IL2 administrado a 1,5 mg/kg por injeção intraperitoneal em 50 µL de PBS estéril uma vez por semana; tratamentos combinados; ou nenhum tratamento (Fig. S1). A ivermectina foi solubilizada em (2-Hidroxipropil)-β-ciclodextrina a 45% (Sigma Aldrich, 332593-1KG) e utilizada na metade da dose diária de 10 mg/kg, conforme descrito anteriormente. A dose e a frequência do tratamento com ivermectina foram otimizadas para eficácia máxima e ausência de toxicidade visível relacionada à droga com base em observações de animais e medições de peso corporal. O crescimento do tumor foi medido 2-3 vezes por semana com um paquímetro digital por até 56 dias. Os camundongos foram sacrificados quando o crescimento do tumor atingiu 1,5 cm de comprimento ou largura. O volume do tumor foi calculado como (comprimento × largura) /2. Os experimentos de metástase foram realizados injetando 0,5 × 106 luciferase expressando células tumorais 4T1 (4T1-Luc) por via subcutânea na glândula mamária de camundongos BALB/c fêmeas, seguido por ressecção cirúrgica do tumor primário no dia 14 após a inoculação. A imagem de bioluminescência in vivo foi usada para monitorar o crescimento metastático, que foi realizado em um sistema de imagem óptica Lago X (Spectral Instruments Imaging, Tucson, AZ). A carga tumoral geral por camundongo foi avaliada semanalmente por meio de imagem de bioluminescência. A recorrência do tumor primário foi reconhecida quando o valor da luciferase do animal excedeu 600.000 fótons/s/cm 2/esteradiano, um limite escolhido porque estava bem acima do limite inferior de detecção reproduzível (510.000) e porque, em experimentos de otimização, 600.000 era o limite mais baixo consistentemente seguido por valores sempre crescentes e, eventualmente, morte. Não houve toxicidade significativa após o tratamento com ivermectina oral combinada com anti-PD1 e IL-2 sistêmicos conforme medido pela perda de peso (Fig. S1).
Camundongos de configuração neoadjuvante e tratamento
Camundongos BALB/c fêmeas foram adquiridos do The Jackson Laboratories com 6–8 semanas de idade e mantidos em instalações de cuidados com animais sob condições livres de patógenos no Instituto de Tecnologia de Massachusetts. Todos os procedimentos foram realizados sob aprovação do Animal Care and Use Committee do MIT.
Um inóculo de 0,5 × 106 células tumorais 4T1-Luc foi injetado subcutaneamente (sc) na glândula mamária em 100 µL de PBS estéril. O início do tumor foi monitorado por palpação (geralmente 3-5 dias após a inoculação). Seis dias após a inoculação, os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento e o tratamento foi realizado conforme indicado na Fig. 2 suplementar. Uma dose de 5 mg/kg de ivermectina foi administrada por gavagem oral em 50 µL de PBS estéril. Anti-PD-1 (clone RMP1-14, BioXCell) foi administrado a 10 mg/kg por injeção intraperitoneal em 50 µL de PBS estéril. MSA-IL2 foi administrado a 1,5 mg/kg por injeção intraperitoneal em 50 µL de PBS estéril.
A ressecção cirúrgica do tumor primário foi realizada no dia 16 após a inoculação do tumor. Camundongos foram injetados com o analgésico Buprenorfina de liberação sustentada (ZooPharm, 1 mg/kg de peso corporal) e meloxicam (2 mg/kg de peso corporal) por injeção subcutânea. Os animais foram anestesiados com isoflurano e a anestesia completa foi confirmada pela falta de reflexo de pinça do dedo do pé. A área cirúrgica foi raspada e esterilizada por esfregaço com aplicação alternada de esfoliante cirúrgico de betadine e etanol a 70%. O tumor e a almofada de gordura mamária circundante foram removidos por dissecção romba usando instrumentos cirúrgicos autoclavados (Braintree Scientific). As feridas foram fechadas com sutura de monofilamento de náilon 4-0 com agulha de corte reverso 3/8 (Ethilon). Os camundongos foram monitorados quanto à consciência em uma área quente e seca imediatamente após a operação. Depois disso, camundongos receberam meloxicam (2 mg/kg de peso corporal) em intervalos de 24 horas por 3 dias após a cirurgia. As suturas foram removidas 7 a 10 dias após a operação.
Os camundongos foram monitorados quanto ao desenvolvimento de metástases começando no dia 10-14 após a ressecção cirúrgica do tumor primário. Os animais foram injetados IP com D-luciferina filtrada estéril (Xenogen) em PBS (150 mg/kg de peso corporal em 200 µL) e anestesiados com isoflurano. Imagens de bioluminescência foram coletadas 10 minutos após a injeção com um IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen). Os tempos de aquisição variaram de 10 a 30 segundos. As imagens foram analisadas usando o software Living Image (Xenogen). Os animais foram monitorados diariamente quanto à morbidade e sacrificados se fossem observados sinais de angústia, incluindo, entre outros, dificuldade para deambular ou respirar, perda significativa de peso (> 20% do peso corporal inicial), má condição corporal (pontuação <2) ou por recomendação da equipe veterinária. A necropsia foi realizada para confirmar a presença de nódulos metastáticos visíveis.
Para avaliar a resposta ao novo desafio, camundongos que sobreviveram ao desenvolvimento de metástase após ressecção cirúrgica ou camundongos de controle ingênuos foram desafiados com uma injeção subcutânea de 0,1 × 106 células 4T1-Luc em 100 µL de PBS estéril no flanco oposto ao local do primário tumor. Os camundongos foram subsequentemente monitorados a cada 2-3 dias para o crescimento do tumor no local da inoculação.
Ensaio ELISPOT
Células alvo 4T1-Luc foram tratadas com IFN-gama de camundongo (Peprotech) por 18 h, lavadas e irradiadas (120 Gy). Os esplenócitos foram isolados de camundongos não tratados ou tratados no dia 16 após a reintrodução do tumor. A quantificação da resposta de IFNγ foi determinada usando um kit ELISPOT de IFNγ de camundongo BD. As células alvo foram semeadas a 0,025 × 106 células por poço. As células efetoras foram semeadas 1,0 × 106 células por poço. As placas foram envolvidas em papel alumínio e incubadas a 37 °C por 24 horas e desenvolvidas seguindo o protocolo do fabricante. As placas foram digitalizadas usando um leitor de placas CTL-ImmunoSpot e os pontos foram enumerados usando o software CTL ImmunoSpot.
Coloração e quantificação de tecidos
Os tumores foram isolados de camundongos e seccionados em seções de 5 µm para coloração com os marcadores desejados (abaixo) usando Tyramide Signal Amplification (PerkinElmer, Waltham MA) de acordo com o protocolo do fabricante. As imagens do tumor inteiro foram digitalizadas usando o sistema de imagem automatizado Vectra 3 (PerkinElmer) e quantificadas usando o software de análise ImagePro.
Citometria de fluxo
Marcadores de superfície celular foram corados por 30 min no escuro a 4 ° C. A coloração de citocinas intracelulares foi realizada usando o kit de coloração ebioscience Foxp3 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) de acordo com o protocolo do fabricante. Os seguintes anticorpos de camundongo da BioLegend (San Diego CA) foram usados: CD4 (GK1.5); CD8 (53-6,7); Tbet (4B10); Gata3 (16E10A23); Foxp3 (MF-14); IFNγ (XMG1.2); IL-10 (JES5-16E3); IL17 (TC11-18H10.1); e TGFβ (TW7-16B4). O RORγt (AFKJS-9) foi encomendado à eBioscience (ThermoFisher Scientific). Para mostrar a reatividade das células T, os esplenócitos foram isolados de camundongos portadores de tumor e cultivados com células 4T1 na proporção de 5:1 (esplenócitos para células tumorais) na presença de anti-CD107A/CD107B (ThermoFisher Scientific) e Monensina por 4 h. Após 4 h, as células foram coradas para marcadores de superfície e intracelulares descritos acima. A análise por citometria de fluxo de marcadores de células T em PBMCs humanos foi realizada usando os seguintes clones: CD8 (RPA-T8); CD4 (SK3); Tbet (4B10); Ki67 (Ki67) da BioLegend; RORγt e granzima B (GB11) da ThermoFisher Scientific.
Análise estatística
Os valores médios foram comparados usando testes t. Os dados sobre o volume do tumor ao longo do tempo foram transformados em log antes da modelagem estatística; antes da transformação, os valores de zero foram substituídos por 0,1. A resposta completa (CR) ao tratamento foi definida como redução permanente do volume do tumor para zero a qualquer momento durante o acompanhamento; nenhum tumor que encolheu a zero retomou o crescimento. O desfecho de sobrevivência competitivo foi a progressão, definida como crescimento do tumor além de 150 mm, após o qual os tumores nunca sofreram CR, mas, em vez disso, tornaram-se necróticos ou grandes, necessitando de eutanásia. O acompanhamento de indivíduos que não apresentaram RC nem progressão foi censurado na última observação, exceto quando a última medição disponível do tumor ficou um pouco abaixo dos 150 mm3 limiar para progressão; em tais casos (n = 2, volume 139 e 141 mm3, respectivamente, na medição final no dia 25), presumiu-se que a progressão ocorreria no que seria a próxima medição programada.
A incidência cumulativa de desfechos competitivos foi calculada e plotada de acordo com Gray. Os resultados relacionados de volume do tumor, CR e progressão foram modelados em conjunto. O submodelo de volume tumoral longitudinal utilizou regressão linear mista, enquanto os submodelos de sobrevivência de CR e progressão utilizaram regressão paramétrica de risco com função Weibull. A significância estatística foi definida como p < 0,05. Um efeito maior do que aditivo (sinergia) da terapia combinada foi demonstrado quando a soma dos efeitos de cada droga isoladamente caiu fora do intervalo de confiança de 95% em torno do efeito da terapia combinada. Para maximizar o poder estatístico e obter resultados imparciais, apesar da falta não aleatória de dados longitudinais devido à morte, cada par de medidas de resultado por ensaio foi modelado em conjunto. Cada modelo conjunto incluiu um submodelo linear de efeitos mistos do resultado longitudinal e um submodelo de sobrevivência. Para manter o risco geral de erro dos ensaios abaixo de 5%, os valores de p para a hipótese primária de sinergia do tratamento combinado foram submetidos ao ajuste de Bonferroni de Hochberg. Separadamente, pós valores das hipóteses secundárias sofreram o mesmo ajuste.