Resumo
O movimento de proteínas entre o citoplasma e o núcleo mediado pela superfamília de proteínas importinas é essencial para muitos processos celulares, incluindo diferenciação e desenvolvimento, e é crítico para estados patológicos, como doenças virais e oncogênese. Recentemente, desenvolvemos uma tela de alto rendimento para identificar inibidores específicos e gerais da importação nuclear de proteínas, dos quais a ivermectina foi identificada como um potencial inibidor do transporte mediado por importina α/β. No presente estudo, caracterizamos em detalhes as propriedades inibitórias do transporte nuclear da ivermectina, demonstrando que ela é um inibidor de amplo espectro da importação nuclear de importina α/β, sem efeito em uma série de outras vias de importação nuclear, incluindo a mediada pela importina β1 sozinha. É importante ressaltar que estabelecemos pela primeira vez que a ivermectina tem atividade antiviral potente contra o vírus HIV-1 e dengue, ambos fortemente dependentes da importação nuclear de importina α/β, com relação à integrase do HIV-1 e NS5 (proteína-não-estrutural 5) proteínas polimerase, respectivamente. A ivermectina parece ser uma ferramenta inestimável para o estudo da importação nuclear de proteínas, bem como a base para o desenvolvimento futuro de agentes antivirais.
Palavras-chave: vírus da dengue, HIV, importina α/β1, ivermectina, importação nuclear.
Abreviaturas: CLSM, microscopia confocal de varredura a laser; DENV, vírus da dengue; DMEM, meio de Eagle modificado por Dulbecco; FBS, soro bovino fetal; GFP, proteína fluorescente verde; hCMV, citomegalovírus humano; Imp, importina; IN, integrase; LMB, leptomicina B; NES, sinal de exportação nuclear; NLS, sinal de localização nuclear; NS5, proteína-não-estrutural 5; PIC, complexo de pré-integração; PTHrP, proteína relacionada ao hormônio da paratireoide; SRY, região determinante do sexo do cromossomo Y; sulfo-NHS-biotina, sulfo-N-hidroxisuccinimida biotina; SUMO, pequeno modificador relacionado à ubiquitina; SV40, vírus símio 40; T-ag, antígeno tumoral grande; Tat, transativador de transcrição; TRF1, proteína 1 de ligação ao fator de repetição telomérica; VSV-G, glicoproteína do vírus da estomatite vesicular.
INTRODUÇÃO
O movimento de proteínas entre o núcleo e o citoplasma é essencial para os principais processos celulares, como diferenciação e desenvolvimento, além de ser crítico para estados patológicos, como doenças virais e oncogênese (1–3). Proteínas com uma massa molecular superior a ~45 kDa geralmente requerem um NLS (sinal de localização nuclear) para obter entrada no núcleo através dos NPCs localizados no envelope nuclear (complexos de poros nucleares). Os NLSs são geralmente reconhecidos por membros da superfamília de proteínas Imp (importina), sendo o reconhecimento de NLS comumente através da proteína adaptadora Impα dentro do heterodímero Impα/β1, ou Impβ1 ou seus homólogos diretamente (4–7). A exportação de proteína nuclear é um processo análogo, pelo qual NES (sinais de exportação nuclear) são reconhecidos pela família exportina de homólogos de Impβ.
Com sete Impαs e >20 Impβs em humanos e uma ampla variedade de sequências NLS/NES conhecidas, a falta de inibidores específicos dificulta a análise dos papéis funcionais desses vários transportadores; atualmente, o inibidor específico de exportina/CRM1 (manutenção da região cromossômica 1) LMB (leptomicina B) é o único composto disponível comercialmente amplamente aceito para inibir o transporte nuclear. Embora outros compostos inibitórios estejam começando a ser desenvolvidos (8–16), incluindo compostos estruturalmente relacionados ao LMB, como ratjadone, inibidores à base de peptídeos e vários inibidores de pequenas moléculas (17–21), estes não estão amplamente disponíveis e não foram extensivamente testados. Claramente, existe uma necessidade urgente de novos e específicos inibidores de componentes da maquinaria de transporte nuclear de células de mamífero.
Anteriormente, desenvolvemos uma abordagem de triagem de alto rendimento para identificar inibidores da importação nuclear de proteína viral (22). Como prova de conceito, visamos a interação da proteína IN (integrase) do HIV-1 com seu receptor de importação nuclear Impα/β. A partir desse processo de triagem/triagem cruzada, identificamos vários inibidores específicos da importação nuclear IN, incluindo mifepristona, mas também identificamos inibidores que pareciam atuar na importação nuclear mediada por Impα/β em geral. Um deles foi a ivermectina, um medicamento antiparasitário de amplo espectro usado em humanos mais comumente para tratar infecções por nematoides, como oncocercose (cegueira dos rios) (23), bem como sarna (24) e piolhos (25). No presente estudo, investigamos os efeitos do tratamento com ivermectina na localização subcelular de inúmeras proteínas de carga contendo NLS, demonstrando que a ivermectina é um potente inibidor do transporte dependente de Impα/β1, sem efeito em proteínas contendo NLSs reconhecidas por métodos nucleares alternativos. vias de importação. É importante ressaltar que pode ser usado para inibir a infecção por HIV e DENV (vírus da dengue), ambos dependem do transporte dependente de Impα/β1 de IN e NS5 (proteína-não-estrutural 5), respectivamente (3, 26) para produção viral eficiente, levantando a intrigante possibilidade de que drogas análogas à ivermectina possam ser potentes agentes antivirais de amplo espectro.
MATERIAIS E MÉTODOS
Geração de GFP (proteína fluorescente verde) proteína de fusão de plasmídeos de expressão de bactérias e mamíferos
Vetores de expressão de células bacterianas ou de mamífero que codificam IN, SV40 (vírus símio 40) T-ag (antígeno tumoral grande), DENV NS5, proteína supressora de tumor p53, hCMV (citomegalovírus humano) fator de processividade UL44 e polimerase UL54, TRF1 (proteína de ligação ao fator de repetição telomérica 1), SRY (região determinante do sexo do cromossomo Y), PTHrP (proteína relacionada ao hormônio da paratireoide), histona H2B, SUMO (modificador relacionado à ubiquitina pequena) conjugando E3 ligase UBC9, Tat (transativador de transcrição) do HIV-1 (27, 28), e o fator de remodelação da cromatina aF10 (29) foram gerados usando a tecnologia de clonagem Gateway (Invitrogen) e vetor pGFP-attC, para expressão da proteína de fusão GFP em bactérias, ou pDest53 (Invitrogen), para expressão da proteína de fusão GFP em células de mamíferos, conforme descrito anteriormente (30).
Cultura celular e transfecção
As células HeLa (adenocarcinoma cervical humano) foram cultivadas em DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% (v/v) de FBS (soro fetal bovino), 1 mM de l-glutamato, 1 mM de penicilina/estreptomicina e 20 mM de Hepes a 37 °C em 5% de CO2. Às 24h antes da transfecção, as células foram semeadas em lamelas de vidro (15 mm × 15 mm). Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) foi usado de acordo com as instruções do fabricante para transfectar DNA nas células HeLa. Quando apropriado, as células foram tratadas com ivermectina a uma concentração final de 25 μM por 1 h antes da imagem. As células foram fotografadas ao vivo 24 h após a transfecção por CLSM (microscopia confocal de varredura a laser) (Bio-Rad 1024ES ou Olympus FV1000) usando uma objetiva de imersão em óleo ×60 ou ×100 conforme descrito anteriormente (30,31). As imagens digitalizadas foram analisadas usando o software de domínio público ImageJ versão 1.43g (NIH) para determinar a razão de fluorescência nuclear (Fn) para citoplasmática (Fc) (Fn/c) de acordo com a fórmula: Fn/c=(Fn−Fb) /(Fc−Fb), onde Fb é autofluorescência de fundo (5, 32, 33). A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Welch e o software GraphPad Prism 5.0.
Purificação de proteínas e dimerização de Impα/β
A proteína NS5 marcada com GFP foi purificada a partir de bactérias como uma proteína marcada com His 6 sob condições desnaturantes (34), enquanto as proteínas Imp foram purificadas a partir de bactérias como proteínas de fusão GST sob condições nativas, conforme descrito em (34-36). Quando apropriado, Impα e Impβ foram pré-dimerizados a 13,6 μM por 15 min à temperatura ambiente (22°C) para gerar o heterodímero Impα/β para estudos de ligação.
Biotinilação de proteínas Imp
Impα foi biotinilado como descrito anteriormente (34) usando o reagente sulfo-NHS-biotina (sulfo-N- hidroxisuccinimida biotina) (Pierce). Resumidamente, 3,5 mg de Imp foi incubado com 250 μl de sulfo-NHS-biotina (1 mg dissolvido em 150 μl de água) em gelo por 2h. A biotina não ligada foi removida por meio de uma coluna PD-10 (GE Healthcare) e a proteína biotinilada resultante foi concentrada em um dispositivo de concentração Amicon-30.
Ensaio de ligação baseado em AlphaScreen
O ensaio AlphaScreen foi realizado em triplicata em placas opacas brancas de 384 poços (PerkinElmer) (34). Resumidamente, 2 μl de 375 nM (concentração final de 30 nM) His 6proteína marcada foi adicionada a cada poço, seguido por 20 μl de Imp na concentração apropriada (geralmente 0-60 nM), preparado por diluição em série em PBS e incubação por 30 min à temperatura ambiente. Todas as adições e incubações subsequentes foram feitas sob iluminação suave devido à fotossensibilidade das esferas. Um volume de 1 μl de uma diluição de 1:10 (em PBS) dos grânulos aceitadores e 1 μl de 2,5% BSA foram adicionados simultaneamente e incubados por 90 min à temperatura ambiente. Um volume de 1 μl de uma diluição de 1:10 das esferas doadoras foi então adicionado para dar um volume final de amostra de 25 μl e a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 2h. O ensaio foi quantificado em um leitor de placas PerkinElmer FusionAlpha, valores em triplicado foram calculados e curvas de titulação (ajuste sigmoidal de três parâmetros) foram plotadas usando o programa gráfico Sigmaplot. Os valores na “zona de engate”, onde a supressão do sinal ocorreu pela presença de muito de qualquer um dos parceiros de ligação, foram excluídos do gráfico final como anteriormente (30,34,37). Estes foram usados para determinar as concentrações ideais de Imp para a tela da biblioteca.
Ensaio de infecciosidade do HIV
As células HeLa plaqueadas em 24 placas de titulação a 40-50% de confluência foram infectadas com 200ng (equivalente de capsídeo)/titulação de VSV-G (glicoproteína do vírus da estomatite vesicular) pseudotipado NL4-3.Luc.RE-HIV em DMEM contendo 50% (v/v) de FBS e incubado a 4°C por 2h para sincronizar a infecção, seguido de incubação a 37°C. Em 2h (para mifepristone) ou 6h (para ivermectina) após a infecção, o vírus foi removido, as células foram lavadas com PBS e as placas de titulação duplicadas foram tratadas com DMEM/10% (v/v) FBS contendo ivermectina a 25 ou 50 μM ou mifepristona a 100 e 200 μM. Às 8h após a infecção, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS e DMEM fresco/10% (v/v) FBS, seguido de incubação a 37°C. Às 48,5h após a infecção, o meio foi removido, as células foram colhidas e lisadas e os lisados foram testados quanto à atividade de luciferase (reagente Steady-Glo; Promega) e concentração de proteína (ensaio de Bradford), de acordo com as instruções do fabricante.
Ensaio de infectividade DENV
As células Vero cultivadas em DMEM/10% (v/v) FBS foram pré-tratadas por 4h com 25 ou 50 μM de ivermectina, ou 25 μM de mifepristona, e então infectadas com DENV-2 (Nova Guiné C) em um MOI (multiplicidade de infecção) de 4 como descrito em (31, 38, 39), e as células foram mantidas em DMEM/2% (v/v) FBS. Em vários momentos após a infecção, o meio de cultura foi coletado e os títulos de vírus, calculados como unidades formadoras de placa/ml, foram determinados usando ensaios de placa em células C6/36 conforme descrito anteriormente (31, 38, 39).