3.3. Potencial de inativação in vitro de SARS-CoV-2 de bromelaína, acetilcisteína e bromAc
Para ambas as cepas de SARS-CoV-2 testadas, os controles de vírus não tratados em 10 5,5 e 10 4,5 TCID 50/mL produziram efeitos citopáticos típicos (CPE) e nenhuma citotoxicidade foi observada para nenhuma das combinações de drogas nas células Vero. Os resultados do CPE óptico foram invariavelmente confirmados pela coloração de glóbulos vermelhos neutros de ponto final. No geral, o tratamento com bromelaína e acetilcisteína sozinho não mostrou inibição viral, todos com CPE comparável aos poços de controle de vírus, enquanto as combinações de BromAc exibiram inativação do vírus de uma maneira dependente da concentração (Figura 2). O tratamento em títulos de vírus de 10 4,5 TCID 50 /mL (Figura 2 B, D) produziu inibição mais consistente de CPE para quadruplicados do que em 105,5 títulos de vírus TCID 50/mL (Figura 2 A, C).
Figura 2. Ensaios de lise celular demonstraram potencial de inativação in vitro de Acetilcisteína e Bromelaína combinadas (BromAc) contra SARS-CoV-2. A viabilidade celular foi medida pela coloração celular com Vermelho Neutro, onde a densidade óptica (DO) é diretamente proporcional às células viáveis. OD baixo significaria lise celular importante devido à replicação do vírus. A cepa SARS-CoV-2 de tipo selvagem (WT) em títulos de 5,5 e 4,5 log 10 TCID 50 /mL (A e B, respectivamente) não mostraram inibição do efeito citopático (CPE) para o tratamento com agente único, em comparação com a condição de controle do vírus do tratamento simulado. As combinações de BromAc foram capazes de inibir o CPE, em comparação com os controles de célula de infecção simulada. O tratamento de uma variante da proteína spike SARS-CoV-2 (∆S) com uma mutação na junção S1/S2 em títulos de 5,5 e 4,5 log 10 TCID 50 /mL (C e D, respectivamente) mostrou resultados semelhantes. As barras representam a média de cada quadruplicada por condição, ilustradas por círculos brancos. ANOVA unidirecional comum foi realizada, usando o controle de vírus de tratamento simulado como condição de controle (**** p < 0,0001, *** p < 0,0005, ** p < 0,003, e * p < 0,05).
Com base nas diretrizes de inativação de vírus estabelecidas pela OMS, um processo robusto e confiável de inativação será capaz de reduzir a replicação em pelo menos 4 logs (Valor de redução Log 10 (LRV) = (tratamento RT-PCR Ct – controle RT-PCR Ct)/3.3; como 1 log 10 ≈ 3,3 Ct). Como tal, RT-PCR foi realizado nos extratos de RNA para medir diretamente a replicação do vírus. Para a cepa de tipo selvagem (WT) a 10 4,5 TCID 50 /mL, LRV bem sucedido > 4 foram observados com 1 de 4 poços, 2 de 4 poços, 3 de 4 poços e 4 de 4 poços para 25, 50, 100 e 250 µg/20 mg/mL de BromAc, respectivamente (Figura 3). Vale ressaltar que em 10 5,5 TCID 50/mL, LRV estavam ligeiramente abaixo do limiar em, em média, 3,3, com 3 de 4 poços e 2 de 4 poços para 100 e 250 µg/20 mg/mL de BromAc, respectivamente (Tabela 1). Para o mutante de proteína spike (∆S) a 10 4,5 TCID 50 /mL, nenhum LRV > 4 bem-sucedido foi observado para 25 µg/20 mg/mL BromAc, mas foi observado em 4 de 4 poços para 50, 100 e 250 µg/20 mg/mL de BromAc (Figura 3). Digno de nota, em 10 5,5 TCID 50 /mL, LRV estava ligeiramente abaixo do limite em, em média, 3,2, com 1 de 4 poços, 2 de 4 poços e 4 de 4 poços para 50, 100 e 250 µg/20 mg/mL BromAc, respectivamente (Tabela 1). No geral, a inativação in vitro da capacidade de replicação de ambas as cepas de SARS-CoV-2 foi observada de maneira dose-dependente, mais fortemente demonstrada em 100 e 250 µg/20 mg/mL de BromAc contra 10 4,5 TCID 50/mL de vírus.
Figura 3. Matriz de limiar dos valores de redução de log 10 (LRV) da replicação do vírus in vitro 96h após tratamento com BromAc em cepas WT e ∆S SARS-CoV-2 em títulos de 5,5 e 4,5 log 10 TCID 50 /mL. LRV foram calculados com a seguinte fórmula: LRV = (RT-PCR Ct de tratamento—RT-PCR Ct controle de vírus)/3,3; como 1 log10 ≈ 3,3 Ct. A matriz de gradiente de cores exibe o número de quadruplicados por condição produzindo um LRV > 4, correspondendo a uma inativação robusta de acordo com a OMS. WT = tipo selvagem; ∆S = spike mutante S1/S2.
Tabela 1. Valores de redução de Log 10 (LRV) da replicação in vitro do vírus 96h após tratamento com BromAc em cepas WT e ∆S SARS-CoV-2 em títulos de 5,5 e 4,5 log 10 TCID 50/mL. Os LRV foram calculados com a seguinte fórmula: LRV = (RT-PCR Ct do tratamento – RT-PCR Ct controle do vírus)/3,3; como 1 log 10 ≈ 3,3 Ct. Cada réplica é descrita. TCID 50/mL = Dose Infecciosa Mediana em Cultura de Tecidos; WT = tipo selvagem; ∆S = spike mutante S1/S2.
A análise celular em tempo real demonstrou uma cinética de replicação comparável para as cepas WT e ∆S SARS-CoV-2 (Figura 4). Nenhuma diferença significativa na viabilidade celular foi observada entre WT e ∆S em qualquer ponto de tempo. A partir de 48h pós-infecção, a viabilidade das células WT e ∆S foram significativamente diferentes em comparação com a infecção simulada (p < 0,05).
Figura 4. Capacidade de replicação de SARS-CoV-2 de WT e ∆S SARS-CoV-2 medida por análise celular em tempo real. Os pontos de dados correspondem à área sob a análise da curva do índice celular normalizado (impedância eletrônica do RTCA estabelecida no momento da inoculação) em intervalos de 12 horas. A viabilidade celular foi então determinada por normalização contra o controle celular correspondente. WT = tipo selvagem; ∆S = spike mutante S1/S2.
Discussão
A combinação de bromelaína e acetilcisteína, BromAc, inibiu sinergicamente a infectividade de duas cepas de SARS-CoV-2 cultivadas em células Vero. A confirmação da proteína e suas propriedades moleculares dependem de sua integridade estrutural e geométrica, que dependem tanto das ligações peptídicas quanto das pontes dissulfeto. A acetilcisteína, como um bom agente redutor, tende a reduzir as pontes dissulfeto e, portanto, alterar as propriedades moleculares da maioria das proteínas. Esta propriedade tem sido amplamente explorada no desenvolvimento de diversas terapias (doença pulmonar obstrutiva crônica, doenças alérgicas das vias aéreas, fibrose cística, pseudomixoma peritoneal, etc.). Mais recentemente, a acetilcisteína tem sido utilizada no desenvolvimento de terapias para infecções respiratórias como influenza e COVID-19, onde a integridade da proteína spike é vital para a infecção. Um mecanismo de ação hipotético poderia ser o desdobramento da glicoproteína spike e a redução de suas pontes dissulfeto.
A proteína spike SARS-CoV-2 é a pedra angular da ligação do vírion às células hospedeiras e, portanto, representa um alvo terapêutico ideal. Uma ação mecânica direta contra esta proteína spike é uma estratégia de tratamento diferente em comparação com a maioria das drogas antivirais existentes, que impede a entrada viral nas células hospedeiras, em vez de atingir a maquinaria de replicação. BromAc atua como um agente bioquímico para destruir glicoproteínas complexas. As competências enzimáticas multipotentes da bromelaína, dominadas pela capacidade de interromper as ligações glicosídicas, complementam de forma útil o forte poder da acetilcisteína de reduzir as pontes dissulfeto. A análise da sequência de aminoácidos da glicoproteína spike SARS-CoV-2 identificou vários locais predeterminados onde o BromAc poderia atuar preferencialmente, como o local S2 rico em pontes dissulfeto, juntamente com outras três pontes dissulfeto em RBD. Paralelamente, o papel do escudo glicosídico em cobrir a spike, que é propenso a ser removido pelo BromAc, tem sido destacado como um elemento de estabilização das transições de conformação RBD, bem como um mecanismo de resistência à resposta imune específica.
Células de mamíferos exibem funções redutoras em sua superfície que são capazes de quebrar ligações dissulfeto, e a regulação desse equilíbrio tiol-dissulfeto provou impactar a internalização de diferentes tipos de vírus, incluindo SARS-CoV-2. As proteínas ACE2 e spike possuem pontes dissulfeto. Quando todas as ligações dissulfeto RBD da proteína spike foram reduzidas a tióis, a ligação do receptor ACE2 à proteína spike tornou-se menos favorável. Curiosamente, a redução das pontes dissulfeto ACE2 também induziu uma diminuição na ligação. Além disso, outros relatórios sugeriram que a bromelaína sozinha poderia inibir a infecção por SARS-CoV-2 em células VeroE6 por meio de uma ação nas ligações dissulfeto. Assim, a perda de infecciosidade do SARS-CoV-2 observada após o pré-tratamento com BromAc pode ser correlacionada ao desdobramento cumulativo das proteínas spike e envelope, com redução significativa de suas pontes dissulfeto pela acetilcisteína, demonstrado in vitro.
Curiosamente, um efeito semelhante do BromAc foi observado contra WT e ∆S SARS-CoV-2. A principal diferença nas sequências de aminoácidos entre o SARS-CoV-2 e o SARS-CoV anterior é a inclusão de um local de clivagem de furina entre os domínios S1 e S2. Este local distinto da proteína spike e seu papel no transbordamento do hospedeiro e na aptidão do vírus é um tópico de muito debate. Digno de nota, ∆S, que abriga uma mutação neste novo local de clivagem S1/S2 e altera o motivo de clivagem, não exibe nenhuma diferença aparente na capacidade de replicação em comparação com a cepa WT. A sensibilidade ligeiramente aumentada de ∆S ao tratamento com BromAc não se deve, portanto, a um viés de replicação basal, mas a mutação talvez possa estar envolvida no aumento do mecanismo de ação do BromAc. No entanto, esses resultados sugerem que, a partir de uma dose limite, o BromAc pode ser potencialmente eficaz em cepas spike mutantes. Esta pode ser uma clara vantagem para BromAc sobre mecanismos imunológicos específicos de uma vacinação específica para spike.
Até o momento, diferentes estratégias de tratamento foram testadas, mas nenhuma molécula demonstrou um efeito antiviral claro. Além disso, dado o resultado heterogêneo da doença dos pacientes com COVID-19, a estratégia de tratamento deve combinar vários mecanismos de ação e ser adaptada ao estágio da doença. Assim, o reaproveitamento do tratamento continua sendo uma estratégia ideal contra o COVID-19, enquanto se espera uma cobertura vacinal suficiente em todo o mundo. Em particular, o desenvolvimento de tratamento precoce direcionado ao nariz, propenso a diminuir a infecciosidade de um paciente e prevenir a progressão para formas pulmonares graves, é apoiado por uma forte justificativa. Hou et al. demonstraram que o primeiro sítio de infecção é a mucosa nasofaríngea, com movimento secundário para os pulmões por aspiração. De fato, o padrão de infectividade das células do trato respiratório seguiu a expressão do receptor ACE2, diminuindo do trato respiratório superior para o tecido alveolar. A razão para ACE2 foi cinco vezes maior no nariz do que no trato respiratório distal. Outros tratamentos de reaproveitamento como anti-séptico nasal foram testados in vitro, como Povidone-Iodine, que demonstrou atividade contra SARS-CoV-2. No presente estudo, mostramos o potencial terapêutico in vitro do BromAc contra SARS-CoV-2 com uma dose eficiente de limiar de 100 µg/20 mg/mL. Como os modelos animais de segurança das vias aéreas em duas espécies até o momento não exibiram toxicidade (dados não publicados), o objetivo é testar a administração nasal da droga em um ensaio clínico de fase I (ACTRN12620000788976). Esse tratamento pode ajudar a mitigar infecções leves e prevenir a infecção de pessoas em contato regular com o vírus, como profissionais de saúde.
Embora nossos resultados sejam encorajadores, há uma série de pontos a serem considerados em relação a essa demonstração. Ou seja, as condições in vitro são fixas e podem ser diferentes das in vivo. Qualquer reação enzimática é influenciada pelo pH do ambiente, ainda mais quando se trata de reações redox como a redução de pontes dissulfeto. O pH da mucosa nasal é, em termos fisiológicos, entre 5,5 e 6,5 e aumenta na rinite para 7,2-8,3. A idade avançada, frequentemente encontrada em infecções sintomáticas por SARS-CoV-2, também induz um aumento do pH da mucosa nasal. Tal intervalo de variação, dependendo das modificações tipicamente induzidas por uma infecção viral, pode desafiar a eficácia de nossa estratégia de tratamento. Outros experimentos in vitro para testar várias condições de pH estão em andamento, mas, em última análise, apenas estudos clínicos serão capazes de avaliar este ponto. Nossos experimentos foram conduzidos em uma linha celular de rim de macaco conhecida por ser altamente permissiva à infecciosidade do SARS-CoV-2. Com a hipótese acima de ruptura do equilíbrio tiol-dissulfeto de lise da proteína S, a eficácia do BromAc no SARS-CoV-2 não deve ser influenciada pelo padrão de protease de membrana. A reprodução deste protocolo experimental com a linha celular Calu-3 do epitélio pulmonar humano (ATCC ® HTB-55™) permitiria que esses pontos fossem abordados, pois a entrada do vírus é dependente de TMPRSS2 e independente do pH, como no epitélio das vias aéreas, enquanto a entrada do vírus nas células Vero é dependente da catepsina L e, portanto, dependente do pH.
No geral, os resultados obtidos no presente estudo em conjunto com estudos complementares sobre as propriedades do BromAc e a caracterização do SARS-CoV-2 revelam uma forte indicação de que o BromAc pode ser desenvolvido em um agente terapêutico eficaz contra o SARS-CoV-2.
Conclusões
Atualmente, não há tratamento terapêutico adequado para SARS-CoV-2 inicial com o objetivo de prevenir a progressão da doença. BromAc está em desenvolvimento clínico pelos autores para cânceres mucinosos devido à sua capacidade de alterar estruturas glicoproteicas complexas. O potencial de BromAc nas proteínas spike e envelope do SARS-CoV-2 estabilizadas por pontes dissulfeto foi examinado e descobriu-se que induz o desdobramento de proteínas recombinantes spike e envelope reduzindo as pontes estabilizadoras dissulfeto. O BromAc também mostrou um efeito inibitório no SARS-CoV-2 mutante de tipo selvagem e spike por inativação de sua capacidade de replicação in vitro. Portanto, BromAc pode ser um agente terapêutico eficaz para infecção precoce por SARS-CoV-2, apesar das mutações, e até mesmo ter potencial como profilático em pessoas com alto risco de infecção.
Contribuições do autor
Conceituação, JA, KP, SJV e DLM; metodologia, JA, GQ, KP, SB e AHM; validação, JA, GQ, KP, VK, SB e AHM; investigação, JA, GQ, KP, VK, SB e AHM; redação—preparação do rascunho original, GQ, KP, VK, AHM, EF e SJV; supervisão, DLM e EF; administração de projetos, SJV; aquisição de financiamento, SJV e DLM. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Esta pesquisa é parcialmente financiada pela Mucpharm Pty Ltd., Austrália.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Uma pré-impressão deste manuscrito foi arquivada em www.biorxiv.org (acessado em 31 de janeiro de 2021) devido à emergência do COVID-19.
Conflitos de interesse
David L. Morris é o co-inventor e cessionário da licença para este estudo e diretor da empresa patrocinadora spin-off, Mucpharm Pty Ltd. Javed Akhter, Krishna Pillai e Ahmed Mekkawy são funcionários da Mucpharm Pty Ltd. Sarah Valle é parcialmente empregado pela Mucpharm para o desenvolvimento do câncer e é apoiado por uma bolsa de estudos do programa de treinamento em pesquisa do governo australiano. Vahan Kepenekian agradece à Fundação Nuovo Soldati por sua bolsa de estudos e foi parcialmente patrocinado pela Mucpharm Pty Ltd.