Um desparasitante que cura o cancro. Esta é a afirmação de um paciente que teve cancro e que foi curado com um desparasitante.
Além do desparasitante usou também:
- FENBENDAZOLE
- Suplementos de vitamina E
- ÓLEO DE CBD (óleo de canabidiol)
FENBENDAZOL COMO UMA POTENCIAL DROGA ANTICANCERÍGENA (ESTUDO CIENTÍFICO)
Abstrato
Justificativa/Objetivos: Avaliar a atividade anticancerígena do fenbendazol, um anti-helmíntico amplamente utilizado com mecanismos de ação que se sobrepõem aos das citotoxinas/radiossensibilizadores nitroheterocíclicos seletivos para hipóxia e aos taxanos.
Materiais e Métodos: Usamos células de tumor mamário de camundongo EMT6 em cultura celular e como tumores sólidos em camundongos para examinar os efeitos citotóxicos e antitumorais do fenbendazol como agente único e em regimes de combinação. Resultados: Tratamentos intensivos com fenbendazol foram tóxicos para células EMT6 in vitro; a toxicidade aumentou com o tempo de incubação e sob condições de hipóxia grave. Fenbendazol não alterou as curvas dose-resposta para radiação ou docetaxel; em vez disso, os agentes produziram citotoxicidades aditivas. Febendazol em regimes de intensidade máxima não alterou o crescimento de tumores EMT6, ou aumentar os efeitos antineoplásicos da radiação.
Conclusão: Esses estudos não forneceram evidências de que o fenbendazol teria valor na terapia do câncer, mas sugeriram que essa classe geral de compostos merece uma investigação mais aprofundada.
O fenbendazol, éster metílico do ácido (5-(feniltio)-1H-benzimidazol-2-il) carbâmico, é amplamente utilizado para tratar oxiúros, outros helmintos e uma variedade de infecções parasitárias em animais de laboratório, gado, animais de companhia e pessoas. Ficamos interessados no fenbendazol quando os veterinários da nossa universidade recomendaram que todos os roedores experimentais, incluindo colônias não infectadas como a nossa, fossem tratados com uma dieta contendo fenbendazol devido a infecções por oxiúros em algumas colônias. Nossa pesquisa usa tumores em ratos e camundongos para avaliar os efeitos de novos regimes de tratamento de tumores sólidos com radiação e/ou drogas anticancerígenas. À medida que pesquisávamos este tratamento profilático proposto, ficamos preocupados com a possibilidade de que a ração contendo fenbendazol pudesse comprometer nossos experimentos, mas também ficamos intrigados com a possibilidade de que essa droga pudesse ter efeitos antineoplásicos, interrompendo o equilíbrio dos microtúbulos da tubulina ou alterando a viabilidade ou radiossensibilidade de células nos ambientes hipóxicos encontrados em tumores sólidos.
O fenbendazol atua principalmente nos helmintos ligando-se à tubulina e interrompendo o equilíbrio dos microtúbulos da tubulina; sua utilidade como antiparasitário resulta de diferenças nas estruturas da tubulina em células de mamíferos e em organismos inferiores, o que leva a sua maior ligação à tubulina e, portanto, maior inibição da polimerização nos parasitas. Além disso, a absorção limitada de fenbendazol no intestino resulta em baixos níveis da droga e seus metabólitos ativos no tecido em relação aos níveis no intestino, aos quais os parasitas-alvo são expostos.
Várias drogas anticancerígenas amplamente utilizadas produzem seus efeitos antineoplásicos interrompendo a formação de microtúbulos (vincristina; vinblastina) ou a despolimerização de microtúbulos (paclitaxel; docetaxel), sugerindo que o fenbendazol pode ter efeitos antitumorais. Alguns dados da literatura corroboram essa hipótese. Uma dieta contendo fenbendazol combinada com altas doses suplementares de vitaminas foi relatada por Gao et al. para inibir o crescimento de um linfoma humano xenoenxertado em camundongos scid; não ficou claro se isso refletia um efeito direto da droga nas células tumorais ou na estimulação das respostas imunes do hospedeiro. Bai et al. relataram que o fenbendazol reduziu o enxerto de tumores cerebrais em camundongos nus. Chung et al. relataram em uma apresentação em reunião que altas doses de fenbendazol, albendazol e mebendazol inibiram o crescimento de tumores resistentes ao paclitaxel.
Os tumores sólidos desenvolvem regiões de hipóxia grave muito cedo em seu desenvolvimento, com diâmetros inferiores a 1 mm. À medida que os tumores crescem, eles provocam concomitantemente o desenvolvimento de seus leitos vasculares por meio de angiogênese, neovascularização e cooptação de vasos de tecidos normais. No entanto, os leitos vasculares do tumor carecem da organização e regulação encontradas na vasculatura que suporta os tecidos normais saudáveis. Os vasos são tortuosos e irregulares e carecem da musculatura que normalmente regula o fluxo sanguíneo. Extremidades cegas e desvios são comuns, e os vasos frequentemente apresentam orifícios microscópicos e macroscópicos que permitem que o plasma ou sangue vaze para o tecido circundante. Além disso, os tumores em crescimento frequentemente invadem ou comprimem os vasos sanguíneos e linfáticos, comprometendo ainda mais a perfusão. Como resultado, os tumores sólidos contêm regiões, onde interrupções temporárias no fluxo sanguíneo através de vasos individuais ou deficiências regionais persistentes na perfusão produzem hipóxia transitória e crônica. Como o oxigênio molecular é um potente radiossensibilizador químico, as células tumorais hipóxicas são resistentes à radiação, podem sobreviver a regimes de radiação que erradicariam populações de células totalmente aeróbicas e podem causar a recorrência de tumores após a radioterapia. Esforços intensivos em nosso laboratório e em muitos outros têm, portanto, sido dedicados a melhorar o resultado da radioterapia, combinando a radiação com drogas que melhoram a oxigenação do tumor, sensibilizam seletivamente as células hipóxicas à radiação ou matam preferencialmente as células hipóxicas.
Vários compostos relacionados ao fenbendazole têm efeitos seletivos em células hipóxicas. Alguns nitroimidazóis e benzimidazóis atuam como radiossensibilizadores de células hipóxicas, substituindo o oxigênio nas reações químicas que levam à produção de dano ao DNA por radiação ionizante. Essas drogas, portanto, aumentam os efeitos citotóxicos da radiação ionizante na hipóxia, embora não tenham efeito sobre a resposta à radiação das células aeróbicas (que já são radiossensíveis ao máximo devido aos níveis de oxigênio em seu ambiente). Vários benzimidazóis modificados sintetizados por Gupta et al. foram eficazes radiossensibilizadores de células hipóxicas. Além disso, várias séries de substituições dos bis-benzimidazóis se ligam no sulco menor do DNA em sequências específicas de DNA, inibindo assim a atividade da helicase do DNA e a proliferação celular; alguns bis-benzimidazóis sofrem ativação biorredutora em condições hipóxicas, o que poderia produzir citotoxicidade seletiva para células hipóxicas. Muitos benzimidazóis alteram a captação de glicose e o metabolismo de carboidratos, o que pode produzir efeitos citotóxicos nas condições de hipóxia, baixo pH e inadequação nutricional que ocorrem em tumores sólidos.
Devido a essas considerações, testamos dois possíveis efeitos da ração terapêutica para roedores contendo fenbendazol em nosso sistema de modelo de tumor primário: i) alteração do crescimento do tumor, por meio de um efeito citotóxico da droga nas células dentro desses tumores sólidos e ii) alteração da radiossensibilidade do tumor. Não vimos nenhuma evidência de que qualquer efeito ocorreu quando nossos camundongos foram alimentados com a dieta contendo fenbendazol, apoiando a ideia de que esta intervenção profilática não comprometeria nossos estudos. No entanto, os dados de cultura celular desse projeto também mostraram que o fenbendazol administrado continuamente em doses acima das esperadas nos tecidos de roedores alimentados com a dieta terapêutica inibiu drasticamente o crescimento de células tumorais EMT6 in vitro. Isso nos levou a estender nossos estudos publicados anteriormente para examinar os efeitos de doses mais altas de fenbendazol em células tumorais EMT6 in vitro e tumores EMT6 in vivo e para definir com mais rigor as interações dessa droga com a radiação. Esses estudos são relatados aqui.
Materiais e métodos
Células. Todos os experimentos foram realizados usando EMT6, uma linha celular de tumor mamário de camundongo clonada, adaptada para cultura de células. A origem e as características das células EMT6 in vitro e dos tumores EMT6 in vivo e a resposta das células e tumores à radiação e a muitas drogas anticancerígenas foram descritas em nossas publicações anteriores.
Estudos de cultura celular. Células EMT6 colhidas de monocamadas de crescimento exponencial foram semeadas em placas de Petri ou frascos de cultura de vidro contendo meio de Waymouth suplementado com 15% de soro (FetalPlex™) e antibióticos (todos da Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As culturas foram incubadas a 37°C em uma atmosfera úmida de 95% ar/ 5% CO2 por três dias e estavam em meio a um crescimento exponencial no momento do tratamento. A viabilidade celular foi avaliada por tripsinização e suspensão das células no final do tratamento, contando as células com um contador Coulter e avaliando a capacidade das células para formar colônias em cultura celular conforme descrito em detalhes anteriormente. As frações sobreviventes foram calculadas comparando a clonogenicidade das células tratadas com as das células de controle não tratadas plaqueadas no mesmo dia. Se o número de células em culturas tratadas e de controle diferisse, a viabilidade celular também era avaliada usando frações sobreviventes corrigidas pelo rendimento, que consideram tanto a diferença no número de células quanto a diferença na clonogenicidade. Os dados mostrados nos gráficos são médias geométricas ± SEM de vários experimentos independentes. Como alguns agentes de tratamento usados nesses experimentos são bastante eficazes em matar células tumorais, as frações sobreviventes nesses experimentos abrangeram uma ampla faixa (de 1,0 a 0,02); as curvas de sobrevivência são, portanto, plotadas usando eixos Y logarítmicos para permitir uma comparação rigorosa dos dados em toda a gama de sobrevivências observadas.
Em experimentos que examinam os efeitos da hipóxia na citotoxicidade, as culturas foram cultivadas em frascos de cultura de vidro e foram tornadas hipóxicas selando os frascos com juntas de borracha, inserindo agulhas para o influxo e efluxo de gases e gaseificação com uma mistura umidificada de 95% nitrogênio/ 5% CO2, contendo <1 ppm de oxigênio por 2 h antes do tratamento. Fenbendazol (Sigma, St Louis, MO, EUA) foi então injetado através do septo da junta, sem quebrar a hipóxia, e a incubação sob hipóxia foi continuada por 2 h. Em experimentos que examinam os efeitos do fenbendazol na resposta à radiação de células hipóxicas, as culturas foram cultivadas em placas de Petri permanox (MP Biomedicals, Solon, OH, EUA), que permitem a rápida liberação de oxigênio das culturas. Imediatamente após a adição de fenbendazol ou veículo, as culturas foram colocadas em vasos de pressão de aço inoxidável e gaseadas com uma mistura umidificada de 95% de nitrogênio/5% de CO2, contendo <1 ppm de oxigênio por 1 h a 37°C para produzir hipóxia grave, então selado, transportado para o irradiador e irradiado. As culturas aeróbicas foram tratadas de forma análoga, mas foram incubadas sob 95% de ar/5% de CO2. Fenbendazol para estudos de cultura celular foi dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO; Sigma), diluído em meio Waymouth e adicionado ao meio de cultura. As culturas celulares foram irradiadas com raios X de 320 kV produzidos por um irradiador XRAD (Precision X-ray, Branford CT, EUA) a 12,5 mA, filtração de 2 mm de Al e uma taxa de dose de 1,9 Gy/min (células hipóxicas) ou 2,4 Gy/min (células aeróbicas).
Figura 1.
Efeito de doses graduadas de fenbendazol na viabilidade de crescimento exponencial de células EMT6 em cultura celular. A: Sobrevivência de células tratadas com fenbendazole por 2 ou 24 h, então testadas para a sobrevivência celular usando um ensaio de formação de colônias. As sobrevivências são mostradas como frações sobreviventes e como frações sobreviventes com rendimento corrigido (YCSF), que são corrigidas para diferenças no número de células em culturas tratadas e de controle no final do tratamento. B: Efeito da hipóxia severa na sobrevida das células tratadas por 2 h com fenbendazol. Pontos são médias geométricas ± SEM de dados de três experimentos independentes.
Experimentos examinando as interações de fenbendazol e docetaxel (taxotere) foram realizados usando culturas de crescimento exponencial em placas de Petri. O docetaxel foi dissolvido em DMSO (ambos da Sigma, St Louis, MO, EUA), diluído em solução salina tamponada com fosfato estéril e adicionado ao meio de cultura em volumes dando as concentrações desejadas. 10 μM de fenbendazol foi adicionado às culturas apropriadas alguns segundos antes ou 22 horas antes do tratamento com docetaxel. Para permitir uma comparação visual pronta das curvas de sobrevivência para docetaxel sozinho e em combinação com 10 μM de fenbendazol, os dados são mostrados como frações sobreviventes relativas, que foram calculadas usando a clonogenicidade das culturas de controle não tratadas (para docetaxel sozinho) ou o correspondente culturas tratadas com fenbendazole das mesmas experiências (para fenbendazole mais docetaxel).
Estudos de tumores. Protocolos para experimentos in vivo foram revisados e aprovados pelo Yale Institutional Animal Care and Use Committee; os estudos foram realizados de acordo com as políticas da Universidade de Yale, dos Institutos Nacionais de Saúde e da Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório e com os princípios descritos no Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. Os tumores foram produzidos pela inoculação de 2×105 células tumorais EMT6, suspensas em 0,05 ml de meio de cultura, por via intradérmica na pele do flanco direito raspado de camundongos BALB/cRw fêmeas, 2,5-3 meses de idade, criados em nossa colônia de produção livre de patógenos específicos. As três dimensões ortogonais dos tumores foram medidas três vezes por semana com paquímetro e os volumes dos tumores foram calculados usando a fórmula para um hemi-elipsoide, a forma geométrica que melhor se aproxima de sua forma. Quando os tumores atingiram um volume médio de 100 mm3, aproximadamente duas semanas após a injeção, os camundongos foram estratificados pelo volume do tumor em grupos de tratamento e controle e tratados.
O fenbendazol foi dissolvido em solução salina fisiológica estéril e apirogênica e injetado ip. Os camundongos a serem irradiados foram anestesiados com 100 mg/kg de cetamina mais 10 mg/kg de xilazina e os tumores foram irradiados localmente com 10 Gy de raios-x de 250 kV de um Siemens Stabilipan (Malvern, PA, EUA) administrado a 15 mA, 2 filtração mm Al e uma taxa de dose de 6,4 Gy por minuto, conforme descrito anteriormente. Os corpos e membros dos camundongos foram protegidos para que a dose nos tecidos normais críticos fosse inferior a 0,5 Gy e não causasse lesões significativas.
Cada tumor foi medido três vezes por semana até atingir um volume de 1000 mm3. O crescimento tumoral foi comparado calculando-se o tempo necessário para cada tumor crescer desde o volume na randomização até quatro vezes esse volume, e comparando-se esses tempos para grupos que receberam diferentes tratamentos. Como os tumores foram medidos em uma faixa de volumes de ~1 mm 3 a ~1000 mm3, as curvas de crescimento na figura são plotadas usando um eixo Y logarítmico, para permitir comparações rigorosas de volumes nos diferentes grupos em toda a faixa de crescimento tumoral; os pontos são médias geométricas ± SEM dos volumes dos tumores individuais dentro do grupo.
Figura 2.
Efeito do tratamento com 10 μM de fenbendazol na resposta à radiação de células EMT6 in vitro. As culturas foram tratadas com doses graduais de radiação sob condições aeróbicas ou hipóxicas e testadas quanto à sobrevivência celular usando um ensaio de formação de colônias. Pontos são médias geométricas ± SEM de dados de três experimentos independentes.
Em cada medição, os camundongos também foram pesados e examinados quanto à aparência (por exemplo, condição do pelo, aparência dos olhos) e comportamento (por exemplo, mudanças na higiene, movimento espontâneo ou resposta ao manuseio, ou taxa e padrão respiratório) para detectar quaisquer sinais de toxicidade da droga, o tratamento com radiação ou os tumores crescentes; os animais eram sacrificados se níveis de toxicidade pré-especificados ocorressem. Após a eutanásia, os camundongos foram necropsiados para avaliar infiltração local e disseminação metastática pelo tumor. Os pulmões (sítio mais comum de metástases para esta linha tumoral) foram removidos, fixados em solução de Bouin, lavados em etanol 95% e armazenados em etanol. Os tumores nas superfícies pulmonares foram contados sob um microscópio de dissecação por um observador cego.
Resultados
Efeitos do fenbendazol na sobrevivência de células EMT6 em cultura. O efeito de tratamentos de 2 e 24 h com fenbendazol na viabilidade de células EMT6 são mostrados na Figura 1. A incubação de 2 h com fenbendazol não foi tóxica para células aeróbicas EMT6 e não produziu alterações no número de células nas culturas em monocamada, mesmo em doses próximas ao limite de solubilidade da droga. O tratamento de 24 horas com fenbendazol resultou em reduções significativas tanto no número de células nas culturas ao final do tratamento quanto na clonogenicidade dessas células. Como resultado, as frações sobreviventes corrigidas pelo rendimento foram menores do que as frações sobreviventes (Figura 1). A hipóxia grave durante o tratamento aumentou a toxicidade dos tratamentos de 2 horas com fenbendazol (Figura 1); os números de células em culturas tratadas em hipóxia não foram significativamente diferentes daqueles em culturas de controle ou culturas tratadas em ar. Todas as curvas de sobrevivência tinham uma forma semelhante, caracterizada por uma diminuição acentuada na viabilidade em baixas doses de droga, seguida por um platô no qual a viabilidade celular permaneceu relativamente constante à medida que a concentração aumentava para se aproximar do limite de solubilidade.
Figura 3.
Efeito de três injeções ip de Fenbendazol no crescimento e resposta à radiação de tumores EMT6 em camundongos BALB/cRw. Camundongos portadores de tumor foram randomizados em um volume tumoral médio de 100 mm3 para servir como controles não tratados, para receber três injeções ip diárias com 50/mg/kg/dia de fenbendazol nos horários mostrados pelas três setas escuras, para receber 10 Gy de raios-x administrados no momento indicado pela grande seta aberta, ou para receber Fenbendazole mais raios-x. Pontos são médias geométricas±SEM; 7-8 camundongos/grupo. Análises adicionais desses dados são apresentadas na Tabela I.
Efeitos do fenbendazol na radiossensibilidade celular. Como a estrutura química do fenbendazol se assemelha àquelas de compostos conhecidos por atuar como radiossensibilizadores, examinamos o efeito do tratamento com 10 μM de fenbendazol antes e durante a irradiação nas curvas com a dose-resposta de radiação para células hipóxicas e aeróbicas (Figura 2) . O fenbendazol não alterou a resposta à radiação das células EMT6 aeróbicas ou hipóxicas.
Figura 4.
Efeito de 10 μM de fenbendazol na resposta das células EMT6 a doses graduadas de docetaxel. O fenbendazol foi adicionado às culturas alguns segundos ou 22 horas antes do início de um tratamento de 2 horas com doses graduais de docetaxel. As frações sobreviventes relativas foram calculadas usando as culturas de controle não tratadas (somente para docetaxel) ou as culturas correspondentes tratadas com fenbendazol (para fenbendazol + docetaxel) dos mesmos experimentos. Os pontos são médias geométricas ± SEM de três experimentos independentes.
Experimentos com tumores in vivo. Os experimentos mostrados na Figura 3 compararam o crescimento de tumores EMT6 não tratados com o de tumores tratados com três injeções ip diárias de fenbendazole, 10 Gy de raios-x ou fenbendazole mais raios-x. O crescimento dos tumores tratados apenas com fenbendazol foi indistinguível dos tumores de controle (Figura 3). Como esperado, a irradiação dos tumores com 10 Gy produziu uma inibição significativa do crescimento do tumor. A curva de crescimento para tumores irradiados não foi alterada por três tratamentos com fenbendazole administrados um dia antes, 2 h antes e um dia após a irradiação (Figura 3).
Quando cada tumor atingiu um volume de 1000 mm3, o camundongo foi sacrificado e necropsiado. Nem invasão local da parede do corpo nem metástases de linfonodos foram observadas em qualquer camundongo. Não houve diferenças significativas no número de metástases pulmonares em camundongos tratados com fenbendazol e não tratados com drogas, tanto para camundongos não irradiados (teste t não pareado, p = 0,54) quanto para camundongos que receberam irradiação tumoral local (p = 0,44).
O crescimento tumoral após diferentes tratamentos foi rigorosamente comparado calculando o tempo necessário para cada tumor crescer desde seu volume no momento da randomização para tratamento até quatro vezes esse volume e comparando esses tempos para diferentes grupos (Tabela I). Essas análises confirmaram que o fenbendazol não alterou o crescimento de tumores irradiados ou não irradiados. A Tabela também inclui dados de um segundo experimento que examina o efeito do mesmo esquema de três injeções de fenbendazol no crescimento de tumores não irradiados, o que confirma o achado do primeiro experimento (curva de crescimento não mostrada) e também o tempo para aumentar o volume quatro vezes dados do nosso estudo anterior, examinando o efeito do tratamento contínuo com uma dieta terapêutica contendo fenbendazol no crescimento de tumores EMT6 não irradiados e irradiados. Nenhum desses experimentos revelou qualquer efeito significativo do fenbendazol no crescimento ou na resposta à radiação dos tumores EMT6.
A aparência, comportamento e peso dos camundongos foram monitorados em cada medição do tumor ao longo do experimento mostrado na Figura 3. Não houve diferenças na aparência ou comportamento dos camundongos nos grupos tratados com fenbendazol e não tratados com drogas. As análises ANOVA não mostraram diferenças significativas entre os pesos dos camundongos nos quatro grupos ao longo do experimento. Resultados semelhantes foram obtidos em outros experimentos mostrados na Tabela.
Associação de fenbendazol com docetaxel. Devido à sobreposição dos mecanismos de ação do fenbendazol e dos taxanos, examinamos o efeito de 10 μM de fenbendazol, adicionado às culturas alguns segundos antes ou 22 horas antes do docetaxel, nas curvas de sobrevivência de células tratadas com doses graduais de docetaxel por 2 h in vitro (Figura 4). Para permitir uma comparação visual pronta das curvas de sobrevivência para células tratadas com docetaxel sozinho e docetaxel em combinação com 10 μM de fenbendazol, as frações de sobrevivência relativas mostradas na Figura 3 foram calculados usando a clonogenicidade das culturas de controle não tratadas (para docetaxel isolado) ou das culturas correspondentes tratadas com fenbendazole dos mesmos experimentos (para fenbendazole mais docetaxel). De acordo com os dados mostrados na Figura 1, o tratamento de 2 h com fenbendazole não apresentou citotoxicidade significativa nesses experimentos, enquanto o tratamento de 24 h com fenbendazole reduziu a fração sobrevivente para 0,18±0,02 em relação ao controle não tratado. O fenbendazol não alterou a forma da curva dose-resposta do docetaxel. Em vez disso, as curvas de sobrevida com e sem fenbendazol foram sobrepostas quando as sobrevidas foram normalizadas para levar em consideração a toxicidade do fenbendazol isolado. Esses achados mostram que as duas drogas produziram toxicidades aditivas, sem evidência de interações significativas entre os dois agentes. A aditividade foi confirmada por análises de isobolograma.
Tabela I.
Efeitos do fenbendazol no crescimento de tumores EMT6 em camundongos BALB/c. Os tumores nesses três experimentos foram injetados id; o volume do tumor foi medido três vezes por semana desde o momento em que cada tumor se tornou palpável até atingir um volume de 1000 mm3. Quando os tumores atingiram um volume médio de ~100 mm3, os camundongos foram estratificados pelo volume do tumor em grupos e tratados. O tempo necessário para cada tumor crescer de seu volume na estratificação para quatro vezes esse volume foi calculado. O fenbendazol, administrado na dieta ou em três injeções ip diárias, não alterou o crescimento do tumor em tumores não irradiados ou irradiados. Além disso, o fenbendazol não alterou a saúde dos animais e não alterou o número de metástases pulmonares espontâneas observadas na necropsia em nenhum desses experimentos.
Discussão
Outros estudos demonstraram que o fenbendazol pode alterar o crescimento de alguns tumores em camundongos. Por causa disso, estudos anteriores em nosso laboratório examinaram os efeitos de uma dieta terapêutica comercial padrão, comumente usada para prevenir ou tratar vermes em colônias de roedores experimentais, sobre o crescimento e a resposta à radiação de tumores EMT6, para verificar se o uso da dieta comprometeria nossa estudos experimentais de terapia de câncer. Não vimos nenhuma evidência de que a dieta terapêutica alterou o crescimento ou a resposta à radiação dos tumores EMT6. Durante esse projeto, estudos limitados de crescimento celular foram realizados para verificar se as culturas de EMT6 eram sensíveis a essa droga quando administradas em incubações contínuas. O fenbendazol não produziu alterações significativas no crescimento de células EMT6 in vitro nas concentrações de 0,11 e 0,33 μM, mas produziu inibição marcante do crescimento nas doses de 1 e 3 μM. Nessas doses mais altas, também notamos mudanças na aparência das culturas: as células nas culturas tratadas eram mais redondas do que as células de controle e menos firmemente ligadas à superfície de crescimento, de acordo com os efeitos esperados da ruptura do equilíbrio dos microtúbulos da tubulina. Os dados limitados disponíveis sobre a farmacocinética do fenbendazol em roedores sugeriram que a dieta experimental usada em nossos estudos anteriores deveria produzir níveis teciduais máximos de ~ 0,1 μM ou menos. Assim, nossos dados de cultura de células estavam de acordo com os dados de tumor para camundongos alimentados com a dieta anti-helmíntica contendo fenbendazol. No entanto, os dados in vitro também mostraram que concentrações mais altas de drogas tiveram efeitos muito significativos no crescimento dessas células tumorais em cultura.
Os estudos aqui apresentados estenderam este trabalho anterior para examinar os efeitos de doses mais altas de fenbendazol na viabilidade de células EMT6 in vitro, usando um rigoroso ensaio de formação de colônias para medir a sobrevivência celular. Esses dados mostraram que a incubação de 24 horas com altas doses de fenbendazol reduziu a clonogenicidade das células EMT6, bem como reduziu o número de células nas culturas. O fenbendazol, portanto, teve efeitos citotóxicos, bem como citostáticos, nessas células tumorais quando usado em altas concentrações e com incubações longas.
A citotoxicidade de tratamentos de 2 horas com fenbendazol aumentou quando as células tumorais foram tratadas sob hipóxia severa. No entanto, a toxicidade preferencial do fenbendazol em relação às células hipóxicas foi relativamente modesta, e a pequena diferença sugere que é improvável que o fenbendazol tenha utilidade terapêutica como droga anticancerígena seletiva para hipóxia.
Também examinamos o efeito do fenbendazol na resposta à radiação de células EMT6 aeróbicas e hipóxicas in vitro, usando um protocolo que usamos extensivamente em nosso laboratório para identificar e caracterizar compostos radiossensibilizantes. O fenbendazol não alterou a resposta à radiação das células EMT6 em condições aeróbicas ou hipóxicas.
Para garantir que as previsões de nossos estudos de cultura celular se traduzissem em tumores in vivo, testamos o efeito do fenbendazol no crescimento e na resposta à radiação de tumores EMT6, usando três injeções ip diárias de fenbendazol na concentração máxima permitida pela solubilidade da droga. Este regime foi concebido para produzir níveis máximos de fenbendazol em tumores no momento da irradiação, maximizando assim os efeitos de qualquer citotoxicidade preferencial para células tumorais hipóxicas ou qualquer radiossensibilização. Como a absorção de fenbendazol oral é muito limitada, estávamos preocupados que a falta de efeito observada em nossos estudos anteriores pudesse ser um falso-negativo, resultante de má absorção do medicamento ingerido, e não de uma verdadeira falta de atividade antitumoral. No entanto, os estudos aqui relatados mostraram que a administração ip de fenbendazol em um regime intensivo de três dias também não alterou o crescimento ou a resposta à radiação dos tumores EMT6. No geral, nossos dados não fornecem evidências para apoiar um exame mais aprofundado do fenbendazol como um agente potencial para o tratamento de tumores sólidos, sozinho ou em combinação com radiação.
Os efeitos do fenbendazol no equilíbrio dos microtúbulos da tubulina podem criar sinergia ou antagonizar os efeitos de drogas anticancerígenas com um mecanismo de ação que envolve a estabilização ou ruptura dos microtúbulos, como paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, colchicina ou podofilotoxina. Tal sinergismo foi relatado para o benzimidazol relacionado, flubendazol. Para examinar essa possibilidade, examinamos o efeito dos tratamentos com fenbendazol por 2 h (que não produziu citotoxicidade significativa) e 24 h (que produziu citotoxicidade pronunciada), nas curvas de sobrevivência de células EMT6 tratadas com doses graduais de docetaxel por 2 h. Nossos dados não forneceram evidências de interações entre esses dois agentes; as toxicidades de docetaxel e fenbendazol foram estritamente aditivas.
Em conclusão, apesar da sobreposição dos mecanismos de ação do fenbendazol com os das citotoxinas nitro-heterocíclicas seletivas para hipóxia e radiossensibilizadores, os taxanos e os alcaloides da vinca, nossos estudos não forneceram evidências de que o fenbendazol justifique testes adicionais como um agente potencial para uso em terapia do câncer. No entanto, é muito possível que compostos relacionados possam ser valiosos medicamentos anticancerígenos. Dado o interesse atual da Food and Drug Administration dos EUA em examinar a possibilidade de “redirecionar” medicamentos previamente aprovados com características bem definidas e bons dados toxicológicos para novos usos, pode valer a pena explorar outros anti-helmintos desenvolvidos no passado para verificar se essa classe de agentes inclui compostos que podem ser valiosos na terapia do câncer, quer devido a efeitos diferenciais significativos nas células hipóxicas, quer através dos seus efeitos no equilíbrio dos microtúbulos da tubulina. É muito possível que os agentes que não foram procurados para uso como antiparasitários, agentes devido à maior absorção no intestino (e, portanto, maior toxicidade do hospedeiro), possam fornecer novos agentes anticancerígenos ou novos compostos líderes de valor no desenvolvimento de novas drogas anticancerígenas.
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