RESUMO
Apresentamos aqui nossa pesquisa sobre a presença de grafeno em vacinas contra a covid.
Realizamos uma triagem aleatória de nanopartículas semelhantes ao grafeno visíveis na microscopia óptica em sete amostras aleatórias de frascos de quatro marcas diferentes, acoplando imagens com suas assinaturas espectrais de vibração RAMAN.
Por meio dessa técnica, chamada micro-RAMAN, conseguimos determinar a presença de grafeno em algumas dessas amostras, após examinar mais de 110 objetos selecionados por sua aparência semelhante ao grafeno em microscopia óptica. Destes, foi selecionado um grupo de 28 objetos, devido à compatibilidade das imagens e dos espectros com a presença de derivados de grafeno, com base na correspondência desses sinais com aqueles obtidos em padrões e literatura científica.
A identificação de estruturas de óxido de grafeno pode ser considerada conclusiva em 8 delas, devido à alta correlação espectral com o padrão. Nos 20 objetos restantes, imagens acopladas a sinais Raman mostram um nível muito alto de compatibilidade com estruturas de grafeno indeterminadas, porém diferentes do padrão aqui utilizado.
Esta pesquisa permanece aberta e disponibilizada à comunidade científica para discussão. Apelamos a investigadores independentes, sem conflito de interesses ou cooperação de qualquer instituição, para que façam contra-análises mais amplas destes produtos para alcançar um conhecimento mais detalhado da composição e do potencial risco para a saúde destes medicamentos experimentais, lembrando que os materiais de grafeno têm uma potencial toxicidade para os seres humanos e a sua presença não foi declarada em nenhuma autorização de utilização de emergência.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
(Ver imagens e espectros dos objetos selecionados no Anexo 3: RESULTADOS)
A técnica micro-Raman aqui aplicada provou ser muito eficaz para a triagem rápida de um grande número de objetos microscópicos na detecção de microestruturas de grafeno dispersas em amostras complexas. Comparada à espectroscopia macro-Raman de dispersões aquosas inteiras, a combinação com microscopia em micro-Raman tem a vantagem de permitir a associação de impressões digitais espectrais a nanopartículas visíveis ao microscópio óptico. Esta técnica permitiu focar a prospecção em objetos específicos com aparência semelhante ao grafeno, reforçando sua espectroscopia caracterização com imagens acopladas. Neste trabalho, a seleção preliminar de objetos centrou-se em duas tipologias, folhas translúcidas e objetos carbonáceos opacos, devido à sua semelhança visual com formas semelhantes observáveis em padrões após sonicação ou em dispersões de óxido de grafeno (ver Resultados do Anexo 3). A diferença entre ambas as tipologias não se deve à sua composição química, ambas derivadas da grafite, mas apenas ao grau de esfoliação do material grafítico de partida e ao número de camadas sobrepostas, assumindo um limiar de cerca de 10 camadas como limite de referência a considerar que um material grafite (3D) (Ramos-Fernandez, 2017).
De qualquer forma, estava fora do escopo do nosso trabalho caracterizar melhor essas estruturas.
Foram selecionados 110 objetos com aparência de grafeno, em sua maioria localizados na borda das gotículas da amostra após desidratação, dentro ou fora da área de arraste por secagem à temperatura ambiente da fase aquosa original. Destes, outros 28 objetos no total foram selecionados por seu maior grau de compatibilidade espectral com materiais de grafeno relatados na literatura, considerando ambos espectros e imagens. As imagens e espectros RAMAN desses objetos são apresentados no Anexo 3 deste relatório. É interessante notar que as amostras não secam completamente à temperatura ambiente, deixando sempre um resíduo gelatinoso, cujo limite pode ser observado em algumas das fotografias mostradas. A composição deste meio é desconhecida no momento por não ter sido objeto do presente estudo, bem como de outras tipologias de objetos de tamanho micrométrico que puderam ser observados recorrentemente nas amostras em baixa ampliação (40-600X). Os espectros Raman de alguns desses objetos foram obtidos, mas não são mostrados neste estudo por não apresentarem semelhança visual com o grafeno ou grafite.
Uma limitação na obtenção de padrões espectrais definidos com esta técnica tem sido a intensidade da fluorescência emitida por muitos objetos selecionados. Em inúmeras folhas translúcidas com aparência de grafeno, não foi possível obter espectros Raman livres de ruído de fluorescência, portanto a técnica não permitiu obter sinais RAMAN específicos com picos bem definidos em muitas delas. Portanto, nestes objetos a presença de estruturas de grafeno não pode ser afirmada nem descartada. Outra limitação da técnica micro-RAMAN é a baixa qualidade da imagem óptica do equipamento, o que muitas vezes impede a detecção de folhas semelhantes a grafeno de alta transparência, que podem, no entanto, ser observadas em microscópios ópticos com condensador adequado ajustamento. Para esses objetos uma alternativa eficaz de caracterização seria a utilização de outras técnicas complementares de microscopia acopladas à espectroscopia, como XPS com boa óptica ou a obtenção do padrão de difração de elétrons do grafeno por microscopia eletrônica (TEM).
Considerando esses critérios de seleção, os 28 objetos encontrados com potencial identidade de grafeno foram distribuídos em 2 grupos, de acordo com o grau de correlação com o espectro RAMAN do padrão reduzido de óxido de grafeno utilizado (rGO, TMSIGMA ALDRICH). O GRUPO 1 incluiu 8 objetos cujos padrões espectrais eram semelhantes ao espectro do padrão rGO e, portanto, a presença de óxido de grafeno (nº 1-8) pode ser afirmada com certeza. Esta correspondência espectral pode ser considerada inequívoca e é caracterizada por 2 picos dominantes na faixa varrida (entre 1200-1800 cm-1), picos denominados G (~1584 cm-1) e D (~1344 cm-1), característicos de óxidos de grafeno. Essa caracterização pela correspondência espectral entre os sinais dessas nanopartículas e o padrão rGO é ainda reforçada pela aparência microscópica desses objetos, todos eles com aparência carbonácea opaca semelhante à dos objetos padrão, como pode ser visto em as fotografias no anexo dos Resultados. Portanto, podemos afirmar com alto nível de confiança que a identificação de material de grafeno em todas as amostras analisadas do Grupo 1 É CONCLUSIVA, e com alta probabilidade estruturas de óxido de grafeno podem ser atribuídas a essas nanopartículas. Esses objetos do grupo 1 apresentavam tamanho micrométrico na faixa de dezenas de mícrons (mostrados como uma linha azul nas fotografias de alguns deles).
No segundo grupo de 20 objetos (GRUPO 2, nº 9-28), foram detectados sinais RAMAN compatíveis com a presença de grafeno ou estruturas grafíticas, mostrando picos de vibrações RAMAN em torno da banda G (1585-1600 cm-1), compatível com o pico G da estrutura nanocristalina do grafeno ou grafite. Este modo vibracional é gerado pela vibração permitida do fônon no plano do anel aromático (sp2). Sua deriva para frequências mais altas em alguns objetos, tendendo para 1600 cm-1 (deslocamento para o azul), pode ser atribuída a uma ampla variedade de modificações amplamente referidas na literatura, como, por exemplo, o número de camadas de grafeno ou a dopagem com grupos funcionais ou metais pesados outros (Ferrari et al, 2007). Visualmente, este grupo inclui os dois tipos de aparências observadas nas normas: sejam objetos micrométricos opacos com aparência carbonácea (nº 9, 11, 16, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 e 28) ou folhas translúcidas com aspecto de grafeno aparência (nº 10, 12, 13, 14, 18, 19 e 20).
Nos espectros deste grupo 2, os máximos do pico G são acompanhados por outros picos dominantes de atribuição não determinada neste trabalho. Um subgrupo (2.1.) pode ser formado por objetos cujos espectros possuem os dois picos dominantes localizados em faixas de bandas que poderiam ser atribuídas aos dois principais modos vibracionais do óxido de grafeno, G (faixa 1569-1599 cm-1) e D (faixa 1342-1376 cm-1) (objetos nº 11, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26). Considerando em conjunto imagens microscópicas e sinais RAMAN, a atribuição dos espectros deste grupo 2.1 a estruturas grafênicas pode ser feita com alto nível de confiança. Porém, embora as modificações estruturais da rede gerando sinais espectrais diferentes do padrão O rGO usado ainda não foi determinado.
Os sinais de um segundo subgrupo (2.2) de objetos deste Grupo 2 (nº 9, 10, 12, 13, 18, 19, 25, 27, 28) podem ser considerados compatíveis com a presença de estruturas de grafeno devido à presença de máximos na banda G, embora o uso de algoritmos de análise espectral mais detalhados fosse necessário, uma vez que não foram claramente observados picos claros que pudessem ser atribuídos ao modo vibracional D, em torno de 1344 cm-1 no padrão rGO. No entanto, a presença do pico D não é uma condição sine qua non para a atribuição de estruturas de grafeno aos espectros e, em consequência, estes objetos foram selecionados para este relatório porque mostram máximos vibracionais compatíveis nas proximidades da banda G ( faixa 1569-1600 cm-1). Ainda há um debate aberto sobre a interpretação desta banda D e sua frequência e forma variáveis (Ferrari e Robertson, 2004). Conforme delineado na introdução metodológica, a intensidade do pico D, geralmente citada em torno de 1355 cm-1, bem como a relação de intensidade com o pico G (ID/IG) é indicativa do grau de desordem na rede de grafeno, introduzida por diferentes agentes como a dopagem, a introdução de grupos funcionais muito diferentes ou quebras na continuidade da rede. Em materiais grafíticos ordenados este pico D está ausente. Em alguns espectros deste subgrupo 2.2. aparecem outros picos com frequências mais altas (blueshift) que o padrão, cuja atribuição ao modo vibracional D é possível, embora esta atribuição ainda esteja por ser determinada por processamento com análise de algoritmos que estava além do escopo de o presente trabalho.
Portanto, atualmente, para estes espectros podemos apenas afirmar que a ausência ou desvio (deslocamento) do pico D em relação à localização do padrão rGO ainda requer uma interpretação estrutural de acordo com os modelos disponíveis. De acordo com a literatura, tanto as variações no deslocamento dos picos G e D, bem como a sua largura e intensidade variáveis, como a presença de outros picos observados nestes espectros podem ser devidas a modificações muito diversas ainda a serem determinadas, incluindo diferentes graus de desordem, oxidação, dopagem, funcionalização e quebras estruturais. O estudo dessas modificações estava além do escopo deste relatório.
Complementarmente à faixa 1200-1800 cm-1, quando a espectroscopia RAMAN foi estendida até 2800 cm-1 para alguns objetos (nº 3, 8 e 11), foi detectado um pico 2D de baixa intensidade e amplitude de frequência, estando ausente em outros. objetos digitalizados (dados não mostrados). Porém, tanto no padrão rGO quanto em alguns objetos com pico G máximo, a intensidade deste pico sempre foi muito baixa em comparação com os picos G e D dos espectros. Isto pode ser devido ao fato de que, nos óxidos de grafeno, a intensidade relativa do pico 2D (~2700 cm-1) em relação aos picos G e D é bastante reduzida. Portanto, neste estudo dispensamos geralmente a análise do pico 2D por razões de maior eficiência e uso de recursos limitados necessários para digitalizar o maior número possível de objetos dentro de um período de tempo limitado. Em trabalhos futuros, seria interessante examiná-lo para todos os objetos, estimando assim a razão das intensidades I2D/2G naqueles objetos onde se manifesta minimamente neste modo vibracional, o que permitiria fazer estimativas sobre o número de camadas da estrutura.
Os objetos mostrados neste estudo representam uma porção minoritária do total de objetos micrométricos visíveis em baixa ampliação em microscopia óptica de campo claro (100X). Esses objetos foram escaneados e não são mostrados neste estudo porque seus espectros não são compatíveis com estruturas de grafeno, pois não possuem uma banda que possa ser atribuída ao pico do modo vibracional G. É de grande interesse notar que muitos destes objetos mostram máximos de RAMAN na banda 1439-1457 cm-1. Da mesma forma, entre os objetos do grupo 2.2, também é frequentemente encontrado um pico proeminente nesta banda, em torno de 1450 cm-1, em combinação com os picos G e D (nº 11, 12, 14, 15, 16, 17, 20, 21 , 23, 24, 25, 26 e 28). A atribuição desta banda em torno de 1450 cm-1 ainda está pendente, pois não corresponde a picos específicos no grafeno, mas consideramos que é de grande importância para o conhecimento da composição das amostras devido ao aparecimento frequente desta modo vibracional. Como hipótese de trabalho, esta banda é geralmente atribuída a grupos metileno orgânicos -CH2- dobrando o par de hidrogênios- (tesoura).
No entanto, também tem sido referida como uma banda de intensidade moderada associada a anéis aromáticos e, nesse caso, também poderia estar associada ao grafeno (Ferrari e Robertson, 2004). Como afirmado, outra possível atribuição desta banda seria a de um modo vibracional sobreposto de algum composto diferente do grafeno, mais provavelmente, ou mesmo do meio hidrogel remanescente após a secagem, pois em todas as amostras há sempre um resíduo viscoso remanescente após a secagem à temperatura ambiente. Este resíduo pode, em muitos casos, manifestar vibrações RAMAN sobrepostas aos objetos que nele permanecem incrustados, mas não naqueles que aparecem fora do gel, nos limites da zona de arrasto de secagem. Nesse sentido, é possível que este modo vibracional do meio apareça sobreposto aos picos G e D do grafeno nos espectros do subgrupo 2.1. Está fora do escopo deste trabalho caracterizar este meio, bem como todos os componentes da amostra. No entanto, existem algumas substâncias capazes de formar esta matriz de hidrogel cujos sinais RAMAN apresentam modos vibracionais proeminentes em torno desta banda, como o álcool polivinílico (PVA), a metilacrilamida ou o polímero PQT-12 (Mik Andersen, https://corona2inspect.blogspot.com/pessoa.com). É também um facto que algumas destas substâncias têm sido combinadas com o grafeno em desenhos experimentais de biomedicina que podem ser encontrados na literatura científica, por exemplo sinapses artificiais para PQT-12 (Chen e Huang, 2020), gelatinas para regeneração neuronal combinando metilacrilamida com grafeno (Zhu et al, 2016) ou fibras eletrofiadas PVA / GO (Tan et al, 2016). Agora, todas essas hipóteses sobre a atribuição deste pico nas proximidades de 1450 cm-1 permanecem em aberto.
Concluindo, de um total de 110 objetos escaneados, foram encontrados sinais inequívocos para a presença de óxido de grafeno em 8 objetos, e sinais compatíveis com a presença de estruturas de grafite ou grafeno em outros 20 objetos. O restante dos objetos escaneados aqui, das 110 nanopartículas com aparência semelhante ao grafeno, não apresentaram sinais compatíveis com o grafeno, com espectros às vezes dominados pelo excesso de ruído causado pela excessiva intensidade de fluorescência, portanto não podemos atribuir nem descartar a presença de estruturas de grafeno neles.
Como continuação desta linha de trabalho, e embora a nossa análise micro-RAMAN tenha mostraram sinais conclusivos da presença de objetos com estrutura de grafeno, para consolidar a certeza da identificação e aprofundar a caracterização estrutural, seria conveniente realizar análises complementares utilizando técnicas acopladas de microscopia e espectroscopia como espectroscopia XPS, ou difração de elétrons TEM.
Para a presente investigação, a maioria das amostras foi obtida de frascos selados. Além disso, durante a extração das amostras e sua transferência para lâminas para microscopia Raman, trabalhamos em condições assépticas sob câmara de fluxo laminar.
No entanto, a possibilidade de processos de contaminação de amostras durante o fabrico, distribuição e processamento, bem como a aplicabilidade geral destes resultados a amostras comparáveis, precisam ser avaliadas através de uma monitorização de rotina e mais extensiva de lotes semelhantes destes produtos.
Embora os resultados desta amostragem sejam conclusivos no que diz respeito à presença de estruturas grafênicas em algumas amostras analisadas, esta pesquisa é considerada aberta para continuação e é disponibilizada à comunidade científica para replicação e otimização, considerando necessário continuar com um estudo mais detalhado, um estudo espectral exaustivo, baseado em amostragem estatisticamente significativa de frascos similares, e aplicação de técnicas complementares para confirmar, refutar, qualificar ou generalizar as conclusões deste relatório. As amostras analisadas estão devidamente guardadas e disponíveis para futuras colaborações científicas.
CONCLUSÕES
Uma amostragem aleatória de frascos de vacina COVID19 foi realizada usando uma técnica micro-RAMAN acoplada para caracterizar objetos microscópicos semelhantes ao grafeno usando impressões digitais espectroscópicas características da estrutura molecular.
A técnica micro-RAMAN permite reforçar o nível de confiança na identificação do material, acoplando imagens e análise espectral como evidências observacionais a serem consideradas em conjunto.
Foram detectados objetos cujos sinais RAMAN, por semelhança com o padrão, correspondem inequivocamente ao ÓXIDO DE GRAFENO.
Outro grupo de objetos apresenta sinais espectrais variáveis compatíveis com derivados de grafeno, devido à presença de uma maioria de sinais RAMAN específicos (banda G) que podem ser atribuídos à estrutura aromática deste material, em conjunto com a sua aparência visível.
Esta pesquisa permanece aberta para continuação, contraste e replicação. Análises posteriores baseadas em amostragem significativa, utilizando a técnica descrita ou outras complementares, permitiriam avaliar com significância estatística adequada o nível de presença de materiais de grafeno nesses medicamentos, bem como sua caracterização química e estrutural detalhada.
DETECÇÃO DE GRAFENO EM VACINAS COVID19 - ESTUDO