Anticorpos de gema de ovo de galinha (IgYs) bloqueiam a ligação de várias variantes da proteína spike SARS-CoV-2 ao ACE2 humano
Resumo
O vírus SARS-CoV-2 ainda está se espalhando pelo mundo, e há uma necessidade urgente de prevenir e controlar efetivamente essa pandemia. Este estudo avaliou a eficácia potencial dos anticorpos da gema de ovo (IgY) como agente neutralizante contra o SARS-CoV-2. Investigamos o efeito neutralizante dos IgYs anti-spike-S1 no pseudovírus SARS-CoV-2, bem como seu efeito inibitório na ligação dos mutantes da proteína spike do coronavírus ao ACE2 humano. Nossos resultados mostram que os IgYs anti-Spike-S1 mostraram uma potência neutralizante significativa contra o pseudovírus SARS-CoV-2, vários mutantes de proteína spike e até mesmo SARS-CoV in vitro. Pode ser uma ferramenta viável para a prevenção e controle do COVID-19 em andamento.
1. Introdução
A pandemia de COVID-19 em andamento causada pelo coronavírus SARS-CoV-2 da síndrome respiratória aguda grave, uma nova cepa de coronavírus, se espalhou e evoluiu rapidamente desde o final de 2019. Até o momento, o SARS-CoV-2 é responsável por mais de 40 milhões de infecções e mais de 1,1 milhão de mortes relacionadas ao COVID-19 em todo o mundo. É preocupante que ainda não haja vacinas ou medicamentos antivirais disponíveis contra o SARS-CoV-2.
Estudos anteriores demonstraram que o homotrímero de glicoproteína spike (S) na superfície do SARS-CoV-2 desempenha um papel essencial na ligação do receptor ACE2 humano e na invasão do vírus. Portanto, os anticorpos neutralizantes contra a glicoproteína spike SARS-CoV-2 apresentam a abordagem mais promissora contra o COVID-19. Além disso, vários anticorpos neutralizantes que têm como alvo o domínio de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 foram isolados de pacientes convalescentes. Apesar dos avanços, o uso de anticorpos monoclonais no tratamento do COVID-19 enfrenta uma ampla gama de ameaças à segurança que ainda não foram abordadas. Além disso, o alto custo de produção e o baixo rendimento podem dificultar o uso dos anticorpos neutralizantes, principalmente no mundo em desenvolvimento. Portanto, há necessidade de explorar outras estratégias que possam ser economicamente mais adequadas e viáveis na luta contra a prevenção e controle do COVID-19.
O primeiro relato sobre os anticorpos da gema de ovo (IgY) como agente neutralizante contra a toxina tetânica foi publicado em 1893. Três anos depois, Behring e S. Kitasato descobriram a antitoxina diftérica (Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1901). O uso de IgYs não ganhou significado clínico e ampla aplicação até o advento do princípio dos 3Rs que foi descrito pela primeira vez por Russell e Burch em 1959. Os IgYs ganharam mais atenção por suas propriedades químicas estáveis, baixo custo, alto rendimento e melhor desempenho no bem-estar animal. Mais importante ainda, as IgYs não se ligam aos fatores reumatoides humanos, nem ativam o sistema complemento humano, o que minimiza os riscos de inflamação. Como um agente imune passivo contra doenças virais e bacterianas, as IgYs têm potencial para produzir alimentos funcionais e novos medicamentos. Várias formulações de IgY foram aprovadas para tratar a peste dos gansos, peste dos patos e outras doenças pela Farmacopeia Veterinária da China. Os anticorpos IgY também foram aplicados para combater infecções virais humanas, como o vírus sincicial respiratório (RSV), vírus influenza e vírus Coxsackie. Em um estudo, IgYs de coronavírus anti-SARS foram purificados de frango imunizado com coronavírus SARS inativo, e os anticorpos IgY foram capazes de neutralizar o coronavírus SARS in vitro e in vivo.
Aqui, purificamos IgYs anti-spike-S1 de galinhas que foram imunizadas com o domínio S1 da proteína spike SARS-CoV-2 e interrogamos sua capacidade de neutralizar o pseudovírus SARS-CoV-2 usando células Hela com ACE2 humano superexpresso. Além disso, usamos ensaios ELISA de competição para validar a ligação competitiva do IgY a vários mutantes da proteína Spike SARS-CoV-2, bem como à proteína Spike SARS-CoV.
2. Materiais e métodos
2.1. Preparação e quantificação de anti-S1 IgY
A sequência de DNA que codifica S1 da proteína Spike de SARS-CoV-2 foi otimizada por códon e sintetizada pela GenScript USA, Inc (Material Suplementar). O gene foi então subclonado no vetor pFastBac1 para expressão em células de insetos usando o sistema Bac-to-Bac® Baculovirus. O SARS-CoV-2 Spike-S1 otimizado por códon foi expresso em células de inseto Sf9 usando o sistema de expressão de baculovírus/célula de inseto (Fig. S1). A proteína SARS-CoV-2 S1 recombinante purificada foi misturada e emulsionada com adjuvante imunológico de Freund em volume igual e depois usada como imunógeno. Cada galinha foi injetada (intramuscular) com 150 μg da proteína spike recombinante sob as asas, uma vez por semana durante 4 semanas, e então a IgY foi extraída e o título avaliado. Aqui, adotamos uma extração aprimorada conforme descrito por Sock HweeTan, com ligeira modificação para posterior processamento. Removemos lipídios e lipoproteínas e, em seguida, precipitamos o sobrenadante com uma concentração final de 15% de etanol frio, em vez de sulfato de amônio. A pureza das IgYs extraídas foi superior a 80%, sem o resíduo de sulfato de amônio e o processo levou menos de 2h (Fig. S2). Além disso, a centrifugação também pode ser substituída pela filtração, o que torna o processo de extração mais adequado para produção industrial em larga escala. O título de IgYs extraído foi quantificado por ELISA indireto. Resumidamente, os poços da placa ELISA foram revestidos com a proteína recombinante SARS-CoV-2 Spike-RBD expressa em células HEK 293, então diluições seriadas de IgYs foram adicionadas aos poços e diluição 1:10000 de anti-IgY de cabra conjugado com HRP anticorpo foi adicionado.
2.2. Ensaio de neutralização de pseudovírus
A potência de bloqueio de IgYs no pseudovírus SARS-CoV-2 foi avaliada por luminescência gerada por luciferase. Aqui, as células monoclonais Hela com ACE2 superexpresso foram infectadas com o lentivírus que carrega a proteína spike SARS-CoV-2 e o gene repórter da luciferase (GenScript Co., Nanjing, China). A capacidade das IgYs em neutralizar o antígeno foi avaliada pela realização do ensaio de neutralização de pseudovírus, conforme relatado pelo gene repórter da luciferase (Material Suplementar S).
2.3. ELISA de competição
Usamos um ELISA de competição para avaliar a capacidade dos IgYs de inibir a ligação de oito diferentes mutantes de proteínas spike de coronavírus (incluindo sete proteínas spike de SARS-CoV-2 e uma proteína spike de SARS-CoV) ao ACE2 humano. O SARS-CoV-2 RBD ou mutantes RBD (Tabela S2) foram incubados durante a noite a 4℃ em placa de 96 poços de alta ligação. Uma diluição em série de IgY purificado e ACE2 humano marcado com Fc de 0,3 ng/poço (Cat. No. AC2-H5257, ACROBiosystems) foram adicionados à placa revestida e depois incubados por 1h a 37 ℃. Fc anti-humano conjugado com HRP (1:20000) (Cat. No. 109-035-098, Jackson ImmunoResearch) foi adicionado como o anticorpo secundário. O OD450 foi lido pelo leitor de placas. Todos os dados foram analisados usando GraphPad Prism 8.
3. Resultados
Os resultados mostraram que o título ELISA de IgYs atingiu 2 após o terceiro reforço. Os dados do ensaio de neutralização de pseudovírus mostraram que os valores de IC50 para o anti-(SARS-Cov-2) IgYs foi de 270,5 μg/mL, com inibição máxima de 75,86%. Por outro lado, os IgYs de controle não tiveram efeito inibitório óbvio, indicando que os IgYs anti-(SARS-Cov-2) tiveram uma atividade neutralizante (Figura 1). No entanto, em comparação com os anticorpos monoclonais relatados, o valor de IC50 para as IgYs foi relativamente alto. Associamos esse fenômeno ao fato de que, como os outros anticorpos policlonais, apenas cerca de 10% dos IgYs reconheceram especificamente o SARS-CoV-2, e a proporção de IgYs com atividade neutralizante foi ainda menor. Considerando que o IC50 para as IgYs policlonais foi alto, teoricamente, as IgYs deveriam ter múltiplos sítios para a atividade neutralizante.
Figura 1
Curva de taxa de inibição de luminescência do IgY anti-(SARS-Cov-2) (azul) e IgY normal (controle) (vermelho) do ensaio de neutralização de pseudovírus. (Para interpretação das referências a cores nesta legenda de figura, o leitor deve consultar a versão web deste artigo.)
Anti-(SARS-Cov-2) IgYs mostraram competição óbvia com ACE2 na ligação das proteínas spike SARS-Cov-2 de tipo selvagem (IC50 = 309,9 μg/mL) e SARS-Cov (IC50 = 617,9 μg/mL). Além disso, os IgYs também mostraram ligação competitiva aos seis mutantes da proteína spike SARS-Cov-2 (W436R, R408I, N345D, V367F, N345D/D364Y e o mutante mais dominante D614G) com uma faixa de IC50 de 324,0 −490,9 μg/mL (Figura 2).
Figura 2
Inibição competitiva dos oito mutantes de proteína spike de coronavírus conforme determinado por ELISA competitivo.
4. Conclusão
Em resumo, os IgYs anti-Spike-S1 mostraram uma potência neutralizante significativa contra o pseudovírus SARS-CoV-2, vários mutantes S e até mesmo SARS-CoV in vitro. No entanto, a segurança e a eficácia das IgYs ainda precisam ser mais investigadas em modelos animais.
Atualmente, o vírus SARS-CoV-2 ainda está se espalhando pelo mundo e há muito a ser feito para prevenir e controlar a pandemia. O uso de IgYs em formulações de aerossol ou spray no trato respiratório, na cavidade oral e até mesmo no trato digestivo pode ser uma estratégia válida. Pode impedir a invasão do vírus SARS-CoV-2 através da rota de infecção natural. O controle a longo prazo do SARS-CoV-2, no entanto, exigirá uma combinação de ferramentas de imunização ativa e passiva, terapia medicamentosa e outras medidas preventivas.